血清自噬相關蛋白9a、褪黑素水平與高血壓患者并發左心室肥厚的關系

談小余，陳曉琳，王慧，趙珺

天津醫科大學第二醫院，天津300211

高血壓是心腦血管疾病的首要危險因素，全球 約9.72 億高血壓患者［1］，中國成人高血壓患者約2.7 億例［2］，老年人高血壓患病率高達49.1%［1］。左心室肥厚（LVH）是心臟對長期高血壓機械負荷下產生的適應性反應，可導致心肌梗死、心力衰竭、猝死等嚴重心血管事件［3］。自噬是人體清除凋亡、壞死細胞以及殘余物質的主要途徑之一。心肌細胞過度自噬是壓力負荷下的一種代償反應，可引起心肌肥厚。自噬相關蛋白9a（ATG9a）是自噬調控蛋白，在心肌肥厚模型中異常激活［4］。褪黑素（MLT）屬于一種胺類激素，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、降壓功能，還能抵抗長期壓力負荷所致的心肌肥厚［5］。ATG9a、MLT 在高血壓患者并發LVH 中的機制尚不清楚，目前報道較少且集中于基礎研究，少有臨床報道。本研究擬探討ATG9a、MLT 與高血壓患者并發LVH的關系，為其臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年6月—2019年12月我院收治的157 例高血壓患者，納入標準：①高血壓診斷符合《中國高血壓防治指南》［6］；②原發性高血壓；③年齡18周歲以上。排除標準：①繼發高血壓腎病、腦血管疾病、高血壓危象等；②非腎血管性高血壓，存在內分泌性和睡眠呼吸暫停綜合征等繼發性高血壓；③既往有心臟創傷、手術、介入治療病史；④近期急慢性感染，嚴重肝、肺、腎疾病。其中合并LVH 患者77 例（LVH 組）、未合并LVH 患者80 例（對照組）。LVH 診斷標準：經超聲心動圖檢查提示左心室后壁厚度（LVPWT）或室間隔厚度（IVST）≥1.2 cm［7］。本次臨床試驗采用書面形式提交我院倫理委員會，并獲得批準；患者及其直系親屬均知曉本研究目的，并簽署同意書存檔。

1.2 血清ATG9a、MLT 檢測 采用酶聯免疫吸附試驗。受試者入院次日清晨采集空腹靜脈血10 mL，自然凝固后取上層液置于臺式離心機（德國Eppendorf 公司，型號：Centrifuge 5424 R）離心（4 ℃，3 000 r/min，離心時間15 min，離心半徑10 cm），取血清保存于-80 ℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司，型號：DW-86L728J）待檢?？焖俳鈨鲅鍢悠罚?00 μL標準、待測、空白對照樣品加入板孔內；加入50 μL酶交聯物充分混合，常溫孵育60 min；棄孵育液，洗滌樣品孔，加入50 μL 底物A、B，常溫孵育15 min，加入50 μL 終止液充分混合，儀器為酶標儀（美國BioTek 伯騰儀器有限公司，型號：CYT3M）。繪制標準曲線，根據待測樣品標準曲線計算血清ATG9a、MLT水平。

1.3 觀察指標 收集患者年齡、性別、高血壓病程、BMI、基礎疾病、收縮壓、舒張壓、吸煙史、飲酒史、生化指標［采用雅培CELL-DYN Ruby 全自動血細胞分析儀檢測WBC、PLT、Hb，采用雅培AEROSET 型全自動生化分析儀檢測血脂指標：TC、TG、LDL-C、HDL-C、空腹血糖（FPG），采用瑞士Hamilton FAME全自動酶聯免疫分析儀并用酶聯免疫吸附試驗檢測血清C 反應蛋白（CRP）］、超聲心動圖指標［采用So?nos 7500 型心臟彩色多普勒超聲診斷儀（美國Phil?ips）行超聲心動圖檢查，測量左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心房內徑（LAD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、LVPWT、IVST］。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.00 統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較分別采用Student-t檢驗、非參數檢驗；性別、基礎疾病等計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用二元Logistic 逐步回歸分析高血壓患者并發LVH 的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 LVH 組高血壓病程、收縮壓、合并糖尿病比例高于對照組（P 均＜0.05），血清CRP、FPG 水平高于對照組（P 均＜0.05），超聲心動圖指標LAD、LVEDD、LVESD、LVPWT、IVST 大于對照組（P 均＜0.05），LVFS、LVEF 低于對照組（P均＜0.05），見表1。

2.2 兩組血清ATG9a、MLT 水平比較 LVH 組、對照組血清ATG9a 水平分別為（2.35 ± 0.65）、（1.24 ± 0.27）μg/L，血清MLT 水平分別為（2.35 ±0.82）、（5.24 ± 1.69）ng/L，與對照組比較，LVH 組血清ATG9a水平高，血清MLT水平低（P均＜0.01）。

2.3 高血壓并發LVH 的影響因素 以高血壓患者是否并發LVH為因變量，以高血壓病程、收縮壓、合并糖尿病、CRP、FPG、ATG9a、MLT 為自變量，二元Logistic 逐步回歸分析發現，高收縮壓、高ATG9a、高FPG、低MLT 是高血壓患者并發LVH 的危險因素（P均＜0.01），見表2。

2.4 血清ATG9a、MLT 水平診斷高血壓患者并發LVH 的價值 ROC 曲線分析血清ATG9a、MLT 水平診斷高血壓患者并發LVH 的最佳截斷值分別為1.71 μg/L、3.77 ng/L，ROC 曲線下面積（AUC）分別為0.719（95% CI：0.635～0.803，P＜0.01）、0.806（95% CI：0.734～0.878，P＜0.01），基于二元Logis?tic 回歸分析計算ATG9a、MLT 聯合診斷高血壓患者并發LVH 的預測值，結果顯示兩者聯合診斷高血 壓 患 者 并 發LVH 的AUC 為0.912（95% CI：0.862～0.963，P＜0.01），高于ATG9a、MLT 單獨診斷（Z分別為2.846、2.209，P均＜0.05），見圖1。血清ATG9a、MLT 單獨及聯合診斷高血壓患者并發LVH 的靈敏度、特異度、陽性診斷值、陰性診斷值、約登指數見表3。

表1 兩組基線資料比較

表2 高血壓并發LVH的二元Logistic回歸模型結果

表3 血清ATG9a、MLT單獨及聯合診斷高血壓患者并發LVH的效能

3 討論

LVH 是心臟對高后負荷的代償反應，也是導致高血壓心血管事件和死亡的危險因素。高血壓是一種慢性進展性疾病，長期高血壓導致外周靜脈管壁壓力增加，進而增加左心室后負荷，代償性增加心臟輸出做功，以克服和適應外周血管阻力的改變，在這一過程心肌細胞逐漸肥大變厚，進而引起舒張功能障礙、心力衰竭等LVH表現［8-9］。LVH是多因素共同作用的結果，包括遺傳、血流動力學、神經內分泌、炎性反應、氧化應激等，明確與LVH 發病分子機制有助于診斷、評估病情和預后。

圖1 血清ATG9a、MLT單獨及聯合診斷高血壓患者并發LVH的ROC曲線

ATG9a 是自噬體膜蛋白，定位于囊泡/自噬前體膜，參與自噬體形成，介導囊泡蛋白募集以及真核細胞的自噬過程［10］。作為自噬調控蛋白，ATG9a 還能通過激活心肌自噬導致心肌纖維化和肥厚［11］。壓力負荷心肌肥厚模型存在心肌自噬過度激活及ATG9a異常表達，抑制ATG9a 可抑制心肌肥厚［4］。ATG9a在高血壓并發LVH 的機制尚不十分清楚，目前少有ATG9a 在高血壓合并LVH 的報道。本研究觀察發現LVH 組血清ATG9a水平升高，高水平ATG9a是高血壓患者LVH 的危險因素之一，提示心肌自噬是LVH 潛在作用機制，ATG9a 在壓力負荷LVH 中起重要作用。筆者推測ATG9a 參與高血壓合并LVH 的可能機制：高血壓超負荷下，心肌細胞自噬信號通路被激活，自噬前體膜ATG9a 生成增多，促使自噬體合成，ATG9a過度合成和釋放，可導致心肌細胞自噬過度激活，誘導細胞內受損物堆積，促使病理性心肌肥厚進展。KONG 等［12］報道指出，與富含豐富的轉錄本1（NEAT1）、miR-29b 和ATG9a 形成的NEAT1/miR-29b/ATG9a 調控軸，調控胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1 誘導的肝臟星狀細胞自噬和活化，在肝纖維化中發揮重要作用。Ang Ⅱ誘導的肥厚心肌細胞大鼠模型中miR-34a 表達下調、ATG9a表達上調，ATG9a 表達上調了心肌自噬活性和心肌細胞肥大，miR-34a 可靶向抑制ATG9a 蛋白表達和自噬活性，提示miR-34a/ATG9a 軸在心肌肥大發病機制中發揮重要作用［13］。

MLT 是一種由松果體分泌的吲哚類激素，在人體各組織中均有廣泛分布，具有調節情緒、睡眠、免疫等多種生理功能［14］，MLT 也是一種高效氧自由基清除劑，對氧自由基介導的心臟損傷具有保護作用［15］。在壓力負荷誘導的心肌病理肥厚模型中，給予MLT 治療可改善心肌的病理性肥厚程度，并減輕氧化應激反應［16］，提示MLT 對LVH 可能存在保護作用機制。本研究發現MLT 在LVH 組降低，Logistic回歸分析顯示，低MLT是高血壓患者并發LVH 的危險因素，提示MLT參與了高血壓并發LVH 的發病過程。MLT 參與LVH 的機制尚不明確，推測可能有以下兩點：①抑制氧化應激，MLT 通過抑制氧化應激水平阻止左室—微管蛋白改變，抑制左心室重塑［16］。類視色素相關的孤核受體（ROR-α）是MLT的重要介質，通過與位于錳依賴性超氧化物歧化酶（MnSOD）基因啟動子區域的ROR 反應元件結合激活MnSOD，介導MLT在病理性心肌肥厚中的心臟保護作用，提示MLT 在壓力性心肌肥厚中抑制氧化應激作用機制主要通過ROR-α 依賴的抗氧化酶Mn?SOD 實現［17］；②MLT 能通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助激活因子-1 表達，抑制線粒體損傷，減少線粒體凋亡，改善線粒體代謝［18］，或通過抑制CyPa/CD147信號通路［19］，抑制血管緊張素Ⅱ介導的心肌肥厚。

本研究ROC曲線分析結果顯示，ATG9a、MLT診斷高血壓患者并發LVH的截斷值分別為1.71 μg/L、3.77 ng/L，該截斷值下靈敏度分別為75.32%、80.52%，特異度分別為77.50%、81.25%，聯合ATG9a、MLT 可提高診斷高血壓患者并發LVH 的效能，說明ATG9a 升高、MLT 降低的高血壓患者并發LVH 的可能性更大，對LVH 診斷可提供更可靠信息。Logistic 回歸分析結果顯示，收縮壓增高、FPG增高與高血壓患者并發LVH 密切相關。糖尿病患者糖脂代謝紊亂，心肌脂肪酸代謝異常，細胞外基質增加，細胞膜脂蛋白在心肌細胞內沉積，引起心肌肥厚［20］。

綜上所述，高血壓患者并發LVH 患者血清ATG9a升高，MLT降低。ATG9a升高、MLT降低是引起高血壓患者并發LVH 的危險因素之一，聯合檢測ATG9a、MLT可為LVH診斷提供更可靠信息。