高效液相色譜法測定不同產地白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量

（鷹潭市綜合檢驗檢測中心，江西 鷹潭 335000）

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的干燥全草，具有清熱解毒、消癰散結、利水消腫等作用，廣泛應用于毒蛇咬傷，咽喉腫痛，肺熱喘咳，濕熱黃疸，熱淋澀痛，瘡腫熱癰等的治療。白花蛇舌草的化學組分比較復雜，包括多糖、蒽醌類、黃酮類、三帖酸等多種化合物，其中去乙酰車葉草酸甲酯是其主要的有效成分，具有抗菌消炎、利水滲濕、保護肝臟、抑制多種惡性腫瘤細胞生長的作用，也有一定的抵抗誘癌致癌物的作用，此外還有更廣泛的其他生物學效應[1-2]。本研究建立高效液相色譜法（HPLC）測定不同產地白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量，方法簡便、重復性好、準確度高，可應用于白花蛇舌草的質量控制。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世）；DS-3120超聲波清洗器（天津東康）；MSA225PCE電子天平（賽多利斯）；去乙酰車葉草酸甲酯（中國食品藥品檢定研究院，批號111786-201602）；乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[3-10]

色譜柱：Waters SymmetryShield RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（4:96）；檢測波長：236 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；理論板數不低于6000（以去乙酰車葉草酸甲酯峰計）。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對照品16.75 mg，置25 ml量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即制成0.67 mg/ml的對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取藥材粗粉6 g，精密稱定，加水煎煮2 h，煎液濾過，蒸干，殘渣加甲醇溶解，分次轉移至10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取白花蛇舌草樣品，按2.2.2項方法制成供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，得樣品的液相色譜圖。結果見圖1。

圖1 HPLC圖譜

2.3.2 線性關系考察 精密吸取2.2.1項下對照品貯備液5，2.5，1.0，0.5，0.2 ml，分別置于10 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，按2.1項下色譜條件測定。以濃度（C）為橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程A=10 980C-24 969，r=0.9999。結果表明：去乙酰車葉草酸甲酯在13.4～335.0 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取含去乙酰車葉草酸甲酯的對照品溶液10 μl，按2.1項下色譜條件測定，重復進樣5次，以乙酰車葉草酸甲酯的峰面積計算RSD值，結果RSD為0.6 %，表明精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取同一批江西產白花蛇舌草粗粉6份，每份6 g，按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定，分別計算去乙酰車葉草酸甲酯的含量，結果平均含量為0.1288 mg/g，RSD為0.6 %，表明方法的重現性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一批白花蛇舌草供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，10，12，24 h進樣測定各時間點下去乙酰車葉草酸甲酯峰面積，并以去乙酰車葉草酸甲酯的峰面積計算RSD值。結果RSD為1.1 %，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 回收率試驗 精密稱取已知含量的白花蛇舌草粉末（過40目篩）6 g，共9份，分別精密加入去乙酰車葉草酸甲酯對照品溶液1.0，0.5，0.25 ml，再加水200 ml煎煮2 h，煎液濾過，蒸干，殘渣加甲醇溶解，分次轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，按2.1項下色譜條件測定，計算回收率。結果去乙酰車葉草酸甲酯的平均回收率為99.37 %， RSD為0.3 %，表明方法準確，見表1。

表1 回收率試驗結果

2.4 樣品測定

取不同產地的白花蛇舌草藥材，按2.2.2項下方法處理，2.1項下色譜條件測定，計算去乙酰車葉草酸甲酯的含量，結果見表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

3.1 波長的選擇

采用DAD檢測器3D模式進行全波長掃描，結果顯示去乙酰車葉草酸甲酯的最大吸收波長是236 nm，因此確定其檢測波長為236 nm。

3.2 提取方式的選擇

考察了藥材粗粉加水煎煮后蒸干用甲醇溶解直接過濾進樣、藥材粗粉加水煎煮后濾液用ADS-8大孔樹脂洗脫后蒸干溶解進樣、藥材粗粉加水煎煮后濾液用HP-20大孔樹脂洗脫后蒸干溶解進樣等方式，結果顯示藥材粗粉加水煎煮后濾液直接蒸干再用甲醇溶解進樣這種方式樣品峰雜質少，成分較洗脫方式損失少，方法簡單，成本低廉，是最佳的提取方式。

3.3 流動相的選擇

考察了不同流動相甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水、乙腈-水對去乙酰車葉草酸甲酯的分離效果，結果乙腈-水作流動相峰形較好，分離度較高，且流動相簡單，最終確定流動相為乙腈-水（4:96）。