丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響

李 紅，張 云，付丙月，鮮 婧，張相軍，王金虎，石海英

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

常見的心血管疾病有心臟病、高血壓和腦血栓[1]。治療血栓性心血管疾病，通常采用藥物治療，包括抗凝治療，如肝素；抗血小板活化治療，如阿司匹林；抗缺血治療，包括β-受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑與汀類藥物等[2]。已有研究表明，血管損傷破裂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷，可激活血小板處于亢進(jìn)狀態(tài)，進(jìn)而誘發(fā)血栓，因此，抗血小板聚集藥物是治療心血管疾病的有效手段[3]。

丹參是一種名貴的傳統(tǒng)中藥材，廣泛用于多種疾病的預(yù)防和輔助治療，如保護(hù)心臟，預(yù)防心腦血管疾病，抗氧化作用等[4]。復(fù)方丹參滴丸（CDDP）是一種廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)藥物，用于血栓性疾病的臨床治療，能促進(jìn)血液循環(huán)和清除血瘀[5-6]。丹酚酸（salvianolic acid，SA，結(jié)構(gòu)見圖1）是丹參中有抗氧化作用的化合物之一，已有研究表明，丹酚酸有多種藥理活性，包括抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和防止血栓形成等藥理作用[7-8]。已有研究報(bào)道丹酚酸有高效的抗血小板作用，通過調(diào)節(jié)有抗血小板作用的聚集抑制分子cAMP而達(dá)到抑制血小板聚集的目的[9-13]。本文主要研究丹酚酸6種化合物體外對腺苷-5'二磷酸（adenosine-5-diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集的作用，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

圖1 丹酚酸A（SAA）及其二相代謝物A1～A4及丹酚酸B（SAB）化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二元高壓泵和VWD檢測器（美國安捷倫）；TGL-20W 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀儀器）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）；移液槍（德國賽多利斯公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特）；普利生LBY-NJ4型血小板聚集儀（北京普利生）；飛鴿牌TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；血小板聚集儀配套設(shè)備（比濁杯，磁力攪拌子，墨盒，北京普利生）；一次性使用無菌注射器（新華安得）；MS105DU分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

6種丹酚酸（均為本實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC純度＞90 %，SAA、SAB、A1、A2、A3、A4批號(hào)分別為20180101，20180102，20180103，20180104，20180105，20180106）；腺苷二磷酸（ADP，美國Sigma公司）；替格瑞洛（麥克林試劑）；水合氯醛（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑）；無水氯化鈣，葡萄糖，生理鹽水（山東魯抗辰欣）；乙腈（Fisher Chemical）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性健康清潔級(jí)SD大鼠，體重 220 g±20 g，由山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評價(jià)中心提供，審核合格。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。

2 方法

2.1 純度測定

丹酚酸樣品采用Agilent 1100高效液相色譜儀，采用YMC-Pack ODS-A-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為乙腈-0.01 %磷酸水（55:45），流速1.0 ml/min，檢測波長263 nm，進(jìn)樣量20 μl，檢測樣品純度。

2.2 富血小板血漿與貧血小板血漿的制備過程

取健康的雄性SD大鼠，體重約220±20 g，腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后，按抗凝劑與血液的容積比1:9加入3.8%枸櫞酸鈉，采血管與離心管等均用抗凝劑潤管，輕輕搖勻，使抗凝劑與血液充分地混勻，防止其凝固。

采用一次離心法，于22 ℃、1500 r/min離心6 min，取上清即為富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），其余標(biāo)本以8000 r/min離心15 min，即為貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）。重復(fù)離心兩次。將PRP與PPP均置于37 ℃，并加蓋保存，時(shí)間不超過2 h。

2.3 血小板聚集率的測定

用貧血小板血漿調(diào)整富血小板血漿中的血小板數(shù)目為3×108個(gè)/ml，向已調(diào)好數(shù)目的300 μl富血小板血漿中加入2 mol/L無水氯化鈣溶液40 μl，5 %葡萄糖溶液20 μl，20 μl空白溶媒，攪拌混勻，37 ℃保溫5 min，用貧血小板血漿調(diào)零，加入 50 μl ADP誘導(dǎo)劑，其終濃度為50 μmol/L，以誘導(dǎo)血小板聚集，比濁法測定血小板聚集率，作為對照組。

取不同濃度的對照藥物替格瑞洛及丹酚酸化合物代替上述空白溶媒，按上述步驟加到富血小板血漿中，檢測血小板聚集率。檢測結(jié)果用血小板最大聚集率表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 純度結(jié)果

在給定的色譜條件下，采用乙腈-水體系，根據(jù)分離度和峰型等的差異，選擇適當(dāng)比例的流動(dòng)相分離丹酚酸類化合物，結(jié)果見表1。測定結(jié)果表明，HPLC法專屬性好靈敏度高，各化合物純度均大于95 %，純度檢查符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1 人參皂苷原型化合物純度檢查結(jié)果

3.2 血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果

建立大鼠洗滌血小板體外模型，以ADP為誘導(dǎo)劑，替格瑞洛為陽性對照藥，考察丹酚酸類化合物體外對血小板聚集的作用，采用比濁法測定其在5 min內(nèi)的血小板聚集率，平行6次，結(jié)果用IC50表示。利用丹酚酸與血小板相互作用的評價(jià)體系，測定了陽性對照藥物替格瑞洛的IC50值為1.9 nmol/L，與文獻(xiàn)的報(bào)道值在一個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)[3]，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的評價(jià)系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。在相同的評價(jià)系統(tǒng)內(nèi)，分別測定了6種丹酚酸類化合物與血小板的體外相互作用。結(jié)果見圖2。

圖2 丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的體外大鼠血小板聚集作用的劑量反應(yīng)曲線

如圖2所示，6種丹酚酸類化合物對體外ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用的劑量反應(yīng)曲線在形狀上沒有顯著區(qū)別，均呈劑量依賴性，且為正相關(guān)，即隨著丹酚酸類化合物量的增加，其抑制血小板聚集的活性也同樣增加。丹酚酸類化合物對血小板聚集的抑制作用表現(xiàn)出不同的作用程度，計(jì)算丹酚酸類化合物對血小板聚集抑制作用的半數(shù)抑制濃度（IC50值），用于定量表達(dá)其作用效力，見表2。由表2可見，丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的體外大鼠血小板聚集作用的結(jié)果表明，IC50值為0.3～0.9 mmol/L，在mmol/L數(shù)量級(jí)上，抑制作用溫和，推測其副作用較小，有研究價(jià)值。丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的效力不同，但抑制作用差別不大，推測可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，此處尚未進(jìn)行其作用機(jī)制的分析與討論。

表2 丹酚酸和替格瑞洛對ADP誘導(dǎo)的體外大鼠血小板聚集的影響

4 結(jié)論

本文建立了靈敏、快速、準(zhǔn)確的體外血小板聚集評價(jià)系統(tǒng)，研究了丹酚酸等6種化合物對體外血小板聚集的影響，結(jié)果穩(wěn)定可靠。結(jié)果表明，丹酚酸表現(xiàn)出中等的體外抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用。丹酚酸對血小板聚集的抑制作用較溫和，對于慢性病長期用藥的治療有一定意義，且有很好的研究價(jià)值。