清熱化痰合劑質量標準的研究

亓淑芬，張樂青*，丁 健，葛朝暉

（1.陽谷縣人民醫院，山東 陽谷 252300；2.陽谷縣市場監管稽查大隊，山東 陽谷 252300；3.臨沂大學，山東臨沂 252000）

清熱化痰合劑由麻黃、杏仁、浙貝母、金銀花、生甘草等11味中藥組成，是我院傳統經驗方劑，是經過長期臨床實踐，逐步整理完善而形成的有效方劑，用于治療流行性感冒及一般性感冒，癥見發熱、咳嗽、流涕、咽喉腫痛。此方以清熱解毒、化痰止咳為治則，其中金銀花、浙貝母和麻黃為君藥。麻黃堿作為麻黃的主要有效成分，有鎮咳平喘、解熱發汗、抗病原微生物等作用[1]；浙貝母具有散結消痛、清熱化痰等效用[2]；金銀花具有清熱解毒等功效，適用于治療熱毒痛癢、溫病發熱、脹滿下疾等疾病[3]。為了控制本醫院制劑的質量，參照相關文獻，本文采用薄層色譜法（TLC）對方中的麻黃和浙貝母進行定性鑒別，以高效液相色譜法（HPLC）對金銀花中的綠原酸進行含量測定，并且經驗證，制定的方法準確可靠，能有效控制清熱化痰合劑的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；FA1204型天平（上海菁海儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥

麻黃堿對照品（批號：171241-201007），貝母素甲對照品（批號：110750-200609），綠原酸對照品（批號：110753-201716），甘草對照藥材（批號：120904-201318），均由中國食品藥品檢定研究院提供。清熱化痰合劑（批號分別為20190516，20190518，20190520，陽谷縣人民醫院自制）。乙腈，甲醇，醋酸均為色譜純，水為實驗室二次蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 麻黃鑒別 取本品30 ml，加濃氨1 ml，用乙醚萃取兩次，每次30 ml，合并兩次乙醚液，蒸干，殘渣加入二氯甲烷1 ml使其溶解，作為供試品溶液。按清熱化痰合劑處方比例及制劑工藝，制備缺少麻黃的陰性樣品溶液，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。另取麻黃堿對照品適量，加入二氯甲烷，制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點在同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷:甲醇:濃氨（4:1:0.1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴茚三酮試液后，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，結果見圖1。

圖1 麻黃TLC鑒別

2.1.2 浙貝母鑒別 取本品30 ml，加濃氨1 ml，用二氯甲烷萃取兩次，每次30 ml，合并兩次二氯甲烷液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。按清熱化痰合劑處方比例及制劑工藝，制備缺少浙貝母的陰性樣品溶液，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。另取貝母素甲對照品適量，加二氯甲烷制成每1 ml含1 mg貝母素甲的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液各3 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨（17:2:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀溶液至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品溶液相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，結果見圖2。

圖2 浙貝母TLC鑒別

2.2 綠原酸含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h的綠原酸對照品25 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋置刻度，搖勻，作為對照品貯備液。再精密量取對照品貯備液1 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為100 μg/ml對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取清熱化痰合劑2 ml，置入200 ml量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按清熱化痰合劑處方比例及制劑工藝，制備缺少金銀花的陰性樣品溶液，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Unitary C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1 %醋酸溶液-乙腈，按表1進行梯度洗脫；流速：1 ml/min；進樣量：10 μl；柱溫：30 ℃；檢測波長為327 nm。

表1 梯度洗脫時間表

2.2.5 專屬性試驗 分別取對照品溶液，供試品溶液及陰性樣品溶液，按2.2.4項色譜條件測定。結果表明，供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且分離度好，而陰性樣品溶液在此保留時間處無干擾，即本方法的專屬性好。詳見圖3～5。

圖3 陰性樣品溶液HPLC圖譜

圖4 綠原酸對照品溶液HPLC圖譜

圖5 供試品溶液HPLC圖譜

2.2.6 線性關系考察 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度分別為20，40，60，80，100 g/ml的對照品溶液，按2.2.4項色譜條件測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=28.106x-93.03（r=0.9980，n=5）。結果表明綠原酸在20～100 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.2.7 儀器精密度試驗 取綠原酸對照品溶液（濃度為100 μg/ml），連續進樣6次，每次精密吸取10 μl進樣，測得綠原酸峰面積的RSD為0.58 %。結果表明儀器精密度良好。

2.2.8 溶液穩定性試驗 取2.2.2項下供試品溶液，分別于配制后在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時，按2.2.4項色譜條件測定，測得綠原酸峰面積的RSD為0.83 %。結果表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 精密量取同批號的清熱化痰合劑6份，每份各2 ml，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.4項下色譜條件測定。結果綠原酸的平均含量為6.115 mg/ml，RSD為1.38 %，結果表明方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收試驗 精密量取6份已知含量的樣品（綠原酸含量為6.115 mg/ml）溶液，每份1 ml，分別精密加入1 ml綠原酸對照品溶液（3.0061 mg/ml），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.4項下色譜條件進行測定，結果見表2。綠原酸平均回收率為98.06 %，RSD為1.16 %。

表2 回收率試驗結果

2.2.11 樣品的含量測定 分別取3批清熱化痰合劑（批號分別為20190516，20190518，20190520），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.4項下色譜條件測定，3批樣品中綠原酸的含量分別為6.1151，6.106，6.139 mg/ml。

3 討論

麻黃的TLC鑒別中，分別采用正丁醇:冰醋酸:水（8:2:1）[4]、環己烷:三氯甲烷:甲醇（1:3:1）[5]、三氯甲烷:甲醇:濃氨試液（4:1:0.1）[6]為展開劑。結果以二氯甲烷:甲醇:濃氨試液（4:1:0.1）為展開劑時主斑點顯色更加清晰，各斑點間的分離效果好。

在浙貝母的TLC鑒別中，分別選用乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17:2:1）[7]、乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17:2:0.5）[8]、乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液-水（25:1:1:0.1）[9]為展開劑。結果以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17:2:1）為展開劑時主斑點顯色清晰，在與對照品斑點相應的位置上，顯相同顏色的的斑點，陰性對照無干擾。

甘草作為此方劑中的使藥，用量較少，曾對甘草進行TLC鑒別。參考《中國藥典》（2015年版）甘草項下鑒別方法及有關文獻資料，制備供試品溶液、甘草對照藥材溶液、甘草陰性對照溶液，分別選用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）[10]、乙酸乙酯-甲酸-水（8:3:1）[11]為展開劑，甘草陰性對照溶液無明顯干擾，但供試品溶液斑點不清晰，試驗結果不理想，重現性差。故未將此方法收入標準。

綠原酸含量測定中在進行流動相選擇時，分別考察了乙腈-水-冰醋酸（15:85:0.2），乙腈-0.4 %磷酸溶液（12:88）系統，分離效果均不佳，色譜峰不能完全分離。改用0.1 %醋酸溶液-乙腈為流動相，并采用梯度洗脫，色譜峰峰形較好，出峰時間較快，分離度好于其他條件且陰性無干擾。