東北刺人參總皂苷改善睡眠的作用及機制研究

于 爽，閆金銘，黃莉莉，羅煜婷，卞宏生，王艷艷，李廷利

（黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

東北刺人參（Oplopanax elatus Nakai），又名刺參，為五加科刺人參屬的一種多年生藥用植物[1]，其幼葉可食用，根莖部位常作藥用[2]。東北刺人參的生長地區具有顯著的地域特點，目前發現僅在俄羅斯遠東地區、朝鮮北部山區和我國的吉林省長白山地區有其自然分布[3]，由于來源的稀少也被定為國家二類保護植物及吉林省一類保護植物。

現代藥物化學研究顯示東北刺人參具有多種活性物質，主要為多糖類、皂苷類、黃酮類、揮發油、不飽和脂肪酸等[4-5]。其藥理作用也涉及神經系統、免疫系統、內分泌系統、心血管系統的多個方面。東北刺人參在臨床上可用于治療神經衰弱、失眠等癥，動物實驗也表明小鼠腹腔注射刺人參油乳劑，可出現安靜、伏臥、眼瞼下垂的表現。

本實驗室前期研究中，初步確定了東北刺人參改善睡眠的有效部位為60 %乙醇洗脫組分，有效成分主要為皂苷類成分[6]，其改善睡眠作用與中樞神經遞質含量有關[7]，但并未探究其改善睡眠的其他潛在機制。本研究結合以往實驗結果，通過觀察東北刺人參總皂苷對小鼠自主活動及小鼠翻正反射的影響，探討其改善睡眠的作用。通過測定東北刺人參總皂苷對睡眠剝奪小鼠腦部海馬、皮質、下丘腦中白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素4（IL-4）及白細胞介素10（IL-10）含量的影響，探討其可能的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZZ-6型小鼠自主活動儀（成都泰盟科技有限公司）；Synergy MX型酶標儀（美國Bio Tek公司）；XH-B型漩渦混勻器（美堰市康健醫療器具有限公司）；CT15E型低溫離心機（日本日立公司）。

1.2 試藥

東北刺人參，由吉林省集安市野生藥材種植基地提供；地西泮片（山東信宜制藥有限公司，批號：170101）；戊巴比妥鈉（Sigma公司，批號：160R03257Y）；對氯苯丙氨酸（PCPA，Sigma公司，批號：MFCD00002601）；IL-1β ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司，批號：E20180301A）；TNF-α ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司，批號：E20180320A）；IL-4 ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司， 批號：E20180205A）；IL-10 ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司，批號：E20180210A）。

1.3 實驗動物

ICR品系小鼠，SPF級，體重18～22 g，雄性。由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供，實驗動物許可證號碼：SCXK（黑）2018-0004。實驗動物飼養于獨立通風動物房，溫度24±2 ℃，濕度55 %±15 %，12:12 h明暗交替，實驗動物可自由攝取食物和水。

2 方法

2.1 東北刺人參總皂苷的制備

稱取一定量東北刺人參藥材的根莖部，用10倍量的蒸餾水浸泡2 h，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過濃縮至折合生藥1 g/ml。取D101大孔樹脂進行預處理，用乙醇浸泡4 h后，用乙醇以2 BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止。將刺人參水煎液通過經預處理的D101大孔樹脂，靜態吸附3 h后以蒸餾水反復沖洗，直至用薄層色譜檢測無糖顯色，再用4 BV 30 %乙醇洗脫，最后用6 BV 60 %乙醇洗脫直至無皂苷顯色。收集60 %乙醇洗脫液，減壓回收，水浴蒸干，得刺人參總皂苷。

2.2 東北刺人參總皂苷對小鼠自主活動的影響

將50只小鼠隨機分為空白組、刺人參總皂苷低、中、高劑量組及地西泮組，每組10只。其中實驗藥物組經灌胃途徑給予刺人參總皂苷（150，300，600 mg/kg），空白對照組給予同體積蒸餾水，連續7 d。陽性對照組實驗動物給予同體積蒸餾水，連續6 d，第7天灌胃給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）。以上各組實驗動物均于末次灌胃30 min后，放入自主活動測試儀內適應環境20 min。適應后，測定各組小鼠10 min內自主活動次數及站立次數。

2.3 東北刺人參總皂苷對閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠潛伏期、睡眠時間的影響

將60只小鼠隨機分為空白組、刺人參總皂苷低、中、高劑量組及地西泮組，每組12只。其中實驗藥物組經灌胃途徑給予不同劑量刺人參總皂苷，空白對照組給予同體積蒸餾水，連續7 d。陽性對照組實驗動物給予同體積蒸餾水，連續6 d，第7天灌胃給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）。以上各組實驗動物均于末次灌胃30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）。分別記錄各組小鼠從注射戊巴比妥鈉至翻正反射消失的時間及翻正反射消失的時間至翻正反射恢復的時間，即睡眠潛伏期及睡眠時間。

2.4 東北刺人參總皂苷對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發生率的影響

將36只小鼠隨機分為空白組、刺人參總皂苷組及地西泮組，每組12只。給藥組灌胃給予刺人參總皂苷（300 mg/kg），連續7 d，其他兩組給藥方式同前。各組實驗動物均于末次灌胃30 min后，腹腔注射閾下劑量戊巴比妥鈉（35 mg/kg）。以小鼠翻正反射消失為指標，記錄30 min內各組入睡動物只數。

2.5 東北刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠睡眠影響的作用

將30只小鼠隨機分為空白組、PCPA組及刺人參總皂苷+PCPA組，每組10只。刺人參+PCPA組實驗動物經灌胃途徑給予刺人參總皂苷（300 mg/kg）；空白組與PCPA組給予同體積蒸餾水，連續7 d。灌胃第5天，除空白組外的實驗動物經皮下注射途徑給予PCPA（350 mg/kg），空白組經皮下注射途徑給予同體積的生理鹽水溶液，連續 2 d。各組均于末次注射30 min后，經腹腔注射途徑給予戊巴比妥鈉50 mg/kg，記錄各組實驗動物睡眠潛伏期及睡眠時間。

2.6 東北刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠大腦海馬、皮質、下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響

將36只小鼠隨機分為空白組、PCPA組和刺人參總皂苷組，每組12只。給藥組經灌胃途徑給予刺人參總皂苷（300 mg/kg），空白組及PCPA組給予同體積的蒸餾水，連續7 d。在灌胃第5天，除空白組外的實驗動物經皮下注射途徑給予PCPA（350 mg/kg），空白組經皮下注射途徑給予同體積的生理鹽水溶液，連續 2 d。各組實驗動物末次注射30 min后，斷頭取腦，分離海馬、皮質、下丘腦。用冰生理鹽水將各部分腦組織勻漿后，取上清，待測。采用酶聯免疫法，測定小鼠海馬、皮質、下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10的含量。

2.7 統計分析

3 結果

3.1 東北刺人參總皂苷對小鼠自主活動的影響

結果表明，與空白對照組相比較，刺人參總皂苷中劑量與高劑量能降低小鼠自主活動次數和站立次數；刺人參總皂苷中劑量與高劑量小鼠活動次數顯著多于陽性對照組，但在站立次數方面，與陽性組差異不具有統計學意義，見表1。

表1 刺人參總皂苷對小鼠自主活動的影響（±s,n=10）

表1 刺人參總皂苷對小鼠自主活動的影響（±s,n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組；#P＜0.05 vs 陽性對照組

組別 劑量/mg·kg-1 活動次數/次·(10 min)-1站立次數/次·(10 min)-1空白組 - 202.6±43.9 182.4±94.1刺人參總皂苷 150 189.7±43.4 180.7±34.1 300 142.8±62.8*# 112.7±60.9*600 131.3±32.2*# 122.3±43.6*地西泮 2.5 100.4±32.8** 94.7±30.1**

3.2 東北刺人參總皂苷對閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響

結果見表2。由表2可見，與空白對照組相比，刺人參總皂苷能顯著延長小鼠睡眠時間，縮短睡眠潛伏期，但與空白對照組相比較差異無統計學意義。與陽性對照組比較，刺人參總皂苷對小鼠睡眠潛伏期與睡眠時間的影響差異均無統計學意義。

表2 刺人參總皂苷對閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響（±s,n=12）

表2 刺人參總皂苷對閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05 vs 空白對照組

組別 劑量/mg·kg-1 潛伏期/min 睡眠時間/min空白組 - 6.87±2.61 17.14±4.94刺人參總皂苷 150 6.06±1.13 22.47±6.93 300 5.92±1.15 32.07±9.26*600 5.62±1.28 32.26±11.34*地西泮 2.5 4.81±1.75* 36.65±10.58*

3.3 東北刺人參總皂苷對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發生率的影響

結果表明，與空白對照組相比較，刺人參總皂苷能提高小鼠睡眠發生率；與陽性對照組比較，刺人參總皂苷對小鼠睡眠發生率的影響差異無統計學意義，見表3。

表3 刺人參總皂苷對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發生率的影響（n=12）

3.4 東北刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠睡眠的影響

結果表明，給予PCPA可縮短戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠持續時間，與空白組相比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明模型復制成功。給予刺人參總皂苷后，與PCPA組比較，刺人參總皂苷可縮短戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠潛伏期，結果見表4。

表4 刺人參總皂苷聯合PCPA對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響（±s,n=10）

表4 刺人參總皂苷聯合PCPA對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響（±s,n=10）

注：*P＜0.05 vs 空白對照組；#P＜0.05 vs PCPA組

組別 劑量/mg·kg-1 潛伏期/min 睡眠時間/min空白組 - 3.62±0.59 86.2±22.9 PCPA組 350 4.04±0.76 58.7±16.31*刺人參+PCPA組 300/350 2.95±0.38*# 70.2±28.89

3.5 東北刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內海馬、皮質、下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響

與空白組比較，PCPA組小鼠腦內IL-1β、TNF-α含量明顯降低，IL-4及IL-10含量升高。給予刺人參總皂苷后，睡眠剝奪小鼠腦內IL-1β及TNF-α含量升高，IL-4及IL-10含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表5～7。

表5 刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內海馬中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

表5 刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內海馬中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05 vs 空白對照組；#P＜0.05 vs PCPA組

組別 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白組 160.58±22.18 511.25±54.76 84.50±13.79# 320.33±36.77 PCPA組 146.92±23.18 480.50±64.76 100.40±20.01* 316.00±42.80給藥組 147.83±12.58 485.50±80.85 89.65±12.63 314.00±41.36

表6 刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內皮質中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

表6 刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內皮質中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PCPA組

組別 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白組 171.08±17.08## 534.25±66.3# 106.65±14.31 307.00±29.94#PCPA組 134.33±26.25** 451.50±50.92* 94.95±16.33 346.83±39.40*給藥組 138.92±8.73** 491.50±54.06 89.25±16.25* 325.83±31.32

表7 刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

表7 刺人參總皂苷對PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PCPA組

組別 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白組 158.42±11.00 522.75±42.46 88.85±13.02 346.33±34.41 PCPA組 155.42±15.60 510.25±49.81 102.00±13.63 349.83±26.67給藥組 162.00±18.46 672.00±44.44**## 92.75±29.83 331.50±24.55

4 討論

本實驗首先從動物行為藥理學研究入手，探討了東北刺人參總皂苷對小鼠自主活動及閾上閾下戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間和睡眠發生率的影響。目前評價藥物對中樞神經系統的影響，小鼠自主活動實驗是比較簡單、易行的藥理學方法之一[8]。藥物對中樞的興奮或抑制作用通常能通過自發活動次數反映，興奮時活動次數增加，抑制時活動次數減少，所以小鼠自主活動實驗是評價中樞神經系統興奮狀態的一項重要指標[9]。本實驗通過東北刺人參總皂苷對小鼠自主活動的影響可看出東北刺人參有效成分能顯著減少小鼠自主活動，具有明確的鎮靜、抑制中樞的作用。

戊巴比妥鈉協同實驗是考察鎮靜催眠藥物的常用方法[10]。受試藥物若能延長閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間或縮短睡眠潛伏期或增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發生率，則說明受試藥物與戊巴比妥鈉有協同作用，且單純抑制肝藥酶，減少戊巴比妥鈉代謝的藥物不會明顯影響閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發生率[11]。本實驗中給予了東北刺人參總皂苷的實驗動物對閾劑量戊巴比妥鈉能明顯縮短睡眠潛伏期和延長睡眠時間，對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發生率也有顯著提高，且作用與陽性對照藥物無明顯差異，這些結果均顯示東北刺人參總皂苷具有改善睡眠的作用，且此種作用與肝藥酶無關。

一般認為，改善睡眠可降低對免疫相關疾病的易感性，提高免疫力也可改善睡眠狀態[12]。因此，許多免疫增強劑及免疫調節劑都具有調節睡眠時相，改善睡眠質量的作用。同樣的，由于睡眠期間免疫系統會維持其平衡功能，因此，睡眠也成為免疫系統的重要調節劑。另一方面，睡眠不足會影響新陳代謝，可能是慢性炎癥和代謝性疾病發展的危險因素。促炎性細胞因子IL-1，IL-6和TNF會增加非快速眼動睡眠，而消炎性細胞因子（如IL-4和IL-10）會減少睡眠時間[13]。東北刺人參為五加科植物，以往實驗報道證明了東北刺人參具有增強免疫的作用[14]。因此本實驗重點考察了東北刺人參改善睡眠的細胞因子機制。

實驗結果顯示，給藥組實驗動物的腦內不同部位與睡眠相關的細胞因子均發生了不同程度的含量變化，總體顯示為促進睡眠的細胞因子含量增高，抑制睡眠的細胞因子含量降低。說明細胞因子機制可能是刺人參總皂苷改善睡眠作用的機制之一。