Cocktail探針法評價牛樟芝醇提物對人CYP450酶活性的影響

魏文增 趙寧寧 林穎烽 王瑾 王宮

摘 要：目的：研究牛樟芝醇提物對人肝CYP450酶的影響。方法：建立HPLC方法，通過Cocktail探針檢測樟芝醇提物對人CYP450酶的影響。結果：牛樟芝各劑量組對CYP3A4/5有抑制作用;低劑量組對CYP2E1有促進作用，中、高劑量對CYP2D6、1A2、2E1、2C9亞型作用具有促進作用。結論：牛樟芝醇提物能促進人CYP1A2、2C9、2D6、2E1的活性;可以抑制CYP3A4/5代謝。

關鍵詞：Cocktail;探針底物;HPLC;牛樟芝;人肝微粒體

牛樟芝（Antrodia camphorata）又稱樟菇、紅樟等，原產于臺灣的一種珍稀藥用真菌，被稱為“森林紅寶石”，近年來，研究表明其具有解毒保肝、補腎強心、抗癌等[1]神奇功效。

目前，中藥與西藥治療各有其優缺點，而在臨床治療中，為了標本兼治，提高療效，中西藥合用越趨頻繁，但也有許多文獻報道中藥與西藥合用后產生嚴重的不良反應。基于牛樟芝的功效，其在疾病預防與保健方面也受到關注;而牛樟芝與其他藥物合用是否會產生相互作用，導致藥效降低或增強以及毒性反應，還尚未有文獻報道。因此有必要對牛樟芝的代謝進行深入的研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀，戴安公司;MQD-S3恒溫振蕩箱，上海旻泉公司。

1.2 試藥

非那西汀，美托洛爾，奧美拉唑，氯唑沙宗，甲苯磺丁脲，硝苯吡啶，甲硝唑（批號：62-44-2，56392-17-7，73590-58-6，95-25-0，64-77-7，21829-25-4，443-48-1）源葉生物;NADPH（2646-71-1）TCI公司。

1.3 人肝微粒體

人肝微粒體（3MSMC004）武漢普萊特生物有限公司。

2 方法與結果

2.1 終止液配制

取適量的甲硝唑，加乙腈溶解，配成13mg·mL-1備用。

2.2 探針溶液配制

美托洛爾108.12μmol·mL-1、奧美拉唑95.99μmol·mL-1、非那西汀215.96μmol·mL-1、氯唑沙宗216.49μmol·mL-1、甲苯磺丁脲144.19μmol·mL-1、硝苯吡啶93.94μmol·mL-1儲備液，以甲醇為溶劑，按比例配制成Cocktail混合探針。

2.3 孵育體系

肝微粒體10μL、探針2.5μL：美托洛爾/奧美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶，終濃度為30/26.7/60/60/40/26（μmol·L-1）、PBS補至500μL，置37℃孵育5min后，加NADPH 20μL孵育30min。

2.4 樣品處理

向體系加500μL含0.76μmol·mL-1內標（甲硝唑）的乙腈溶液終止反應，渦旋3min后離心（15000r·min-1）15min，取上清，揮干，復溶，過濾，進樣。

2.5 色譜條件

C18柱，流動相為乙腈-磷酸氫二銨緩沖液，梯度洗脫，柱溫35℃，波長230nm，進樣量20μl。色譜圖見下圖，可見探針間分離良好，且未見干擾。

2.6 標準曲線制備

在滅活體系（肝微粒體100℃加熱10min）中加入探針如下：美托洛爾/奧美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶，90/80/180/180/120/78μmol·L-1;60/53.3/120/120/80/52;30/26.7/60/60/40/26;15/13.3/30/30/20/13;75/667/15/15/10/6.5;3.75/3.33/7.5/7.5/5/3.25;1875/1665/375/3.75/2.5/1.625。以樣品與內標峰面積比值為縱坐標，濃度為橫坐標，則方程：美托洛爾Y=0.004X+0.007（R2=09990）、奧美拉唑Y=0.001X+0.004（R2=09985）、非那西汀Y=0.003X+0.002（R2=0.9990）、氯唑沙宗Y=0.002X+0.011（R2=0.9985）、甲苯磺丁脲Y=0.005X+0.005（R2=09995）和硝苯吡啶Y=0.004X-0.006（R2=09990），顯示線性良好。

2.7 精密度試驗

加低、中、高濃度探針：美托洛爾/奧美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶7.5/6.67/15/15/10/65μmol·L-1;30/26.7/60/60/40/26;90/80/180/180/120/78。同2.3—2.5項操作。結果：美托洛爾0.65%—3.61%，奧美拉唑0.38%—8.82%，非那西汀0.27%—3.97%，氯唑沙宗0.26%—3.99%，甲苯磺丁脲0.12%—3.63%，硝苯吡啶0.92%—8.95%。

2.8 回收率試驗

同2.7項操作。結果：美托洛爾103.57%—106.68%，奧美拉唑72.83%—80.46%，非那西汀97.25%—100.43%，氯唑沙宗96.41%—105.23%，甲苯磺丁脲97.26%—104.74%，硝苯吡啶77.15%—89.89%。

2.9 對人CYP450酶亞型影響試驗

分無活性組，無樟芝組，樟芝組。結果顯示，樟芝低劑量組僅對CYP2E1和3A4/5亞型代謝具有顯著作用（P<0.01）;中、高劑量組對CYP2D6、1A2、2E1、2C9、3A4/5亞型的作用具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）如下表。

2.10 統計學處理

實驗數據處理采用GraphPad Prism5.0統計軟件，數據資料采用x-±s表示，組間比較用t檢驗。

3 討論

“Cocktail”探針法[2]，即對單一的受試體，混合多種探針底物同時給藥進而評價CYP酶的活性能更全面反映藥物代謝過程。對CYP酶的測定是進行新藥篩選必須進行的一項臨床前試驗[3]。本實驗中CYP亞型探針底物的選擇依據美國FDA發布的藥物相互作用研究指導原則，經實驗表明該混合底物經代謝后檢測無相互影響。

牛樟芝含有許多復雜生理活性物質成分，其中三萜類是主要活性成分之一[4]，被當成中毒，腹瀉，腹痛等解毒劑[5-7]。但目前還未對其解毒作用的成分和機制進行深入的研究[5]。本實驗通過牛樟芝醇提物對人CYP酶亞型作用，研究結果顯示低劑量組對CYP2E1和3A4/5亞型代謝分別具有顯著的促進和抑制作用，而對其他亞型代謝則無顯著性;此外，牛樟芝醇提物中、高劑量能促進CYP1A2、2C9、2D6、2E1的代謝活性，這可能是其解毒保肝的作用機制之一。本實驗研究結果提示牛樟芝醇提物對人肝微粒體CYP1A2、2C9、2D6、2E1亞型具有誘導作用，對CYP3A4/5亞型顯示一定的抑制作用。

參考文獻：

[1]陳菲，劉訓紅，楊念云，等.樟芝的研究概述[J].中藥材，2011，（11）：1804-1808.

[2]Tanaka E，Kurata N，Yasuhara H.How useful is the "cocktail approach" for evaluating human hepatic drug metabolizing capacity using cytochrome P450 phenotyping probes in vivo[J].J Clin Pharm Ther，2003，28（3）：157-165.

[3]魏文增，黃慧玲，葉麗香，等.鉤吻素子在人和豬、大鼠、猴、犬肝微粒體的酶促動力學及CYP450酶亞型分析[J].福建醫科大學學報，2017，51（2）：82-87.

[4]楊璐，黃正明.牛樟芝研究進展[C].中國醫藥教育協會第三屆三次理事大會暨學術年會論文專輯，2013，228-232.

[5]蔡為明，金群力，蔡青松，等.牛樟芝人工培養及活性成分與藥理作用的研究進展[J].食藥用菌，2015，23（1）：17-23.

[6]李俊鵬，金毅，王平，等.牛樟芝膠囊對大鼠四氯化碳肝損傷的保護作用研究[J].中國藥師，2013，16（7）：964-966.

[7]張薄博，夏永軍，許贛榮.樟芝發酵產品的研究進展[J].食品開發，2012，37（10）：89-91.

基金項目：福建省公益類科研院所專項（2018R1035-9）

作者簡介：魏文增（1988— ），男，漢族，福建福州人，碩士，研究實習員，研究方向：藥物代謝和毒理學研究。