重組酶聚合酶擴增技術在人偏肺病毒快速診斷的方法建立與臨床評價*

唐 娟 劉文毅 劉 霄

廣東省深圳市寶安區松崗人民醫院檢驗科中心實驗室 518105

在臨床上，急性呼吸道感染是目前國內外導致急性病以及致死性疾病的重要病因之一，傳統的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、流感病毒和腺病毒等，但仍有1/3的感染病原尚未完全明確[1-2]。人偏肺病毒(hMPV)最早是由荷蘭學者Van De Hoogen等人在2001年從呼吸道感染嬰幼兒的標本中分離獲取，且近年來在全球范圍內多個國家均有陸續報道，提示了其呈全球流行，可能是社區獲得性呼吸道感染較為常見的一種病原體[3-4]。相關研究報道顯示，hMPV感染會導致上呼吸道或(和)下呼吸道感染，患者主要臨床表現包括咳嗽、咳痰、喘息、流涕、頭痛、乏力和發熱等，部分患者出現低氧血癥[5-6]。然而，hMPV感染患者尚且缺乏明顯的特異性臨床表現，難以依靠臨床癥狀與其他呼吸道病毒感染進行鑒別區分，從而增加了臨床診斷的難度以及病毒傳播的速度。由此可見，建立病原體核酸快速診斷平臺顯得尤為重要，亦是目前國內醫療機構亟待解決的問題之一。病毒核酸檢測的本質是對病毒RNA基因組進行檢測，如RT-PCR、基因芯片、等溫擴增技術、核酸質譜技術以及病毒基因組測序等[7]。重組酶聚合酶擴增(RPA)屬于等溫擴增技術之一，即在固定的溫度條件下即可實現核酸的快速擴增，反應過程無需溫控循環系統，整個過程在10～30min內即可完成[8]。鑒于此，本文通過研究重組酶聚合酶擴增技術在hMPV快速診斷的方法建立與臨床價值，旨在為hMPV的診治提供一種科學的檢測手段，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2017年1月—2019年12月醫院收治的急性呼吸道感染患兒200例納入研究。年齡1～10歲，平均年齡(5.22±1.30)歲；男121例，女79例。入選標準：(1)均因急性呼吸道感染入院接受治療；(2)入院前尚未接受任何相關治療；(3)無臨床病歷資料缺失。剔除標準：(1)心、肝、腎等重要臟器發生嚴重病變者；(2)研究過程中因各種原因退出或失訪者；(3)正參與其他研究者。研究對象父母均簽署知情同意書，且本次研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法 (1)重組酶聚合酶擴增技術快速診斷hMPV的方法建立：團隊前期通過檢索Genbank數據庫，檢索hMPV株基因序列，數據庫已公布了hMPV檢測用相關基因位點、引物及探針等序列信息和文獻報道的信息，針對靶向特定區域設計出引物和熒光探針，并進一步在線BLAST比對驗證，沒有在其他病毒中發現此靶向區域。隨后通過使用病毒株(逆轉錄病毒和噬菌體的生物學特性開發出模擬原病毒的假病毒或質粒)和臨床不同類型陰性標本對此方法學的最低檢測限、包容性、分析特異性和精密度進行臨床評價，并驗證其對臨床不同類型樣本在使用化學釋放法制備所引進物質的干擾試驗。應用生物信息學軟件通過靶向特定區域，對hMPV的N基因和L基因2個位點進行檢測，并設計引物及熒光探針。使用病毒株和陰性對照品對基于重組酶聚合酶擴增技術快速檢測hMPV的方法進行性能評估。進一步驗證并優化臨床不同類型樣本微量核酸釋放法聯合重組酶聚合酶擴增技術檢測方案。(2)直接熒光免疫法檢測：具體操作嚴格參照參考文獻[9]：即由護士采集鼻咽分泌物，負壓吸取1～2ml的分泌物至無菌的生理鹽水溶液吸瓶內，無痰者則在霧化后吸引，待標本采集成功后于2h內送檢。首先以毛細吸管對標本進行反復吹打，移至尖底離心管中以1 000～1 500r/min條件進行時長5～10min的離心處理，去除上清液，留沉淀。加入5ml的PBS溶液進行洗滌，劇烈混勻10～15s，再次按照上述離心條件進行離心處理，將上清液和沉淀上的黏液層去除，避免攪亂細胞沉淀，重復洗滌5次左右，直至沉淀上的黏液層徹底除去，最后留取0.5～1ml的細胞懸液，于樣片上點樣，每點加入25μl的細胞懸液，待其自然干燥后，以冷丙酮進行時長為10min的固定處理，風干。隨后選擇樣本片或對照片的每個細胞點加入相應的熒光抗體，在37℃溫盒中孵育30min，以洗滌液洗滌后加入1滴封閉液，封片后于熒光顯微鏡下觀察結果。診斷陽性標準如下：熒光顯微鏡下觀察可見細胞內出現蘋果綠色熒光，且200倍顯微鏡下任一視野找到2個及2個以上熒光細胞。

1.3 觀察指標 比較兩種檢測方式的診斷效能，分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情況。

2 結果

2.1 兩種檢測方式的診斷效能評價 以RT-PCR檢測結果為金標準，重組酶聚合酶擴增技術診斷hMPV的靈敏度、特異度、準確度分別為97.56%、98.74%、98.50%，均明顯高于直接熒光免疫法檢測的85.37%、93.71%、92.00%(均P<0.05)。見表1～2。

表1 兩種檢測方式的診斷結果評價

表2 兩種檢測方式的診斷靈敏度、特異度、準確度評價(%)

2.2 hMPV感染患者合并其他病毒感染情況分析 hMPV感染患者合并其他病毒感染發生率為26.83%，其中主要涵蓋冠狀病毒9.76%、呼吸道合胞病毒7.32%、流感病毒4.88%等。見表3。

表3 41例hMPV感染患者合并其他病毒感染情況分析

3 討論

在臨床上，hMPV的流行病學包括以下幾點特征[10-12]：(1)明顯的季節性，即多發于冬春季節；(2)可感染不同年齡階段人群，且以5歲以下兒童以及老年人群為主；(3)hMPV病毒可單獨感染易感人群，亦可和其他呼吸道病毒發生混合感染；(4)hMPV已遍布全球。隨著近年來相關研究的日益深入，不少學者提出對所有年齡階段的呼吸道疾病患者實施hMPV病毒檢測，從而抑制病毒的傳播速度[13-14]。然而，因國家藥品監督管理局體外診斷試劑目錄尚無hMPV核酸檢測試劑盒，從而使得臨床醫療機構無法開展hMPV核酸檢測服務，僅有少數的科研機構可開展相關檢測服務，特別是在新型冠狀病毒防控時期，對急性傳染病病原學鑒別診斷造成了一定的難度，因此，尋找一種積極有效的病原體核酸快速診斷方式具有極其重要的意義。重組酶聚合酶擴增技術是近年來所開發的一種有望替代PCR的新型核酸擴增技術，其主要基于重組酶聚合酶介導的擴增原理，體外模擬生物體內DNA復制，于恒溫條件下即可對目的片段實施擴增，尤其適用于多種病原的快速檢測中[15-17]。

重組酶聚合酶擴增技術主要依賴可結合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結合蛋白以及鏈置換DNA酶，上述三種酶的混合物于常溫狀態下亦有一定活性，且最佳反應溫度為37℃左右，反應過程中無需模板鏈的預變性，可在恒定低溫條件下10～20min內快速擴增目的DNA或RNA[18-19]。相較于傳統聚合酶鏈式反應而言，重組酶聚合酶擴增技術具有反應溫度恒定、擴增速度快、檢測成本低、使用儀器簡單以及結果可靠等優勢，尤其適用于現場快速檢測，對急需診斷結果的患者而言意義十分重大。本研究發現，以RT-PCR檢測結果為金標準，重組酶聚合酶擴增技術診斷hMPV的靈敏度、特異度、準確度均明顯高于直接熒光免疫法檢測。分析原因，筆者認為重組酶聚合酶擴增技術對檢測設備的要求較低，甚至可通過人體體溫完成對樣品的檢測，同時對檢測樣品要求較低，僅需采用簡單的裂解液裂解60s便可作為模板，尤其適用于實地檢測。與此同時，該技術的特異性較佳，且靈敏度較高，可和RT-PCR相媲美。臨床體會，重組酶聚合酶擴增技術除了靈敏度、特異度較高以及適用于現場樣品檢測后，還具備以下幾點優勢：(1)可實現多重反應，同時并快速地檢測多重樣品；(2)反應速度迅速，往往在5～20min內便可完成檢測，在速度方面展現出來的優勢遠遠優于PCR以及HDA等技術；(3)操作簡便，且能和多種檢測方式相結合，繼而提高臨床診斷價值；(4)檢測過程中有效減少所需能力以及成本，利于推廣應用。然而，重組酶聚合酶擴增技術仍存在一定的不足之處：如相關產物在瓊脂糖凝膠電泳檢測過程中，必須對產物實施純化，從而避免產物之外的其他成分對檢測結果造成的影響；反應溫度在37℃左右，且反應時間較短，在對大量樣品進行同時檢測過程中，不易控制反應的同時進行；迄今為止尚無專門的軟件對重組酶聚合酶擴增技術引物以及探針實施設計和篩選。另外，hMPV感染患者合并其他病毒感染發生率為26.83%，這提示了部分hMPV感染患者往往合并其他病毒感染，從而可能增加臨床治療難度，應予以重視。然而，蔡勇等人的一項研究報道表明[20]：223例hMPV陽性患兒同時檢出其他病毒感染人數42例，占比18.83%，明顯低于本研究結果。而導致兩項研究發生差異的主要原因可能和研究樣本量以及年齡階段不同有關，值得臨床關注。

綜上所述，重組酶聚合酶擴增技術在hMPV快速診斷中的應用價值較高，可獲得較為理想的靈敏度、特異度以及準確度，有望成為替代傳統PCR的有效檢測方式，值得臨床推廣應用。然而，該技術尚且存在一定的不足之處，有待今后的持續改進。