鱖視覺轉變期視網膜感光細胞層的發育

張瑞祺，張炎，趙金良*

(1.上海海洋大學 農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306； 2.水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306； 3.水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；4.上海工程技術大學，上海 201306)

視網膜作為魚類視覺系統中負責成像的重要結構，與其生活習性與捕食習性息息相關[1-3]。視網膜主要依靠感光細胞層完成光線感知與目標成像，感光細胞按其功能不同分為視桿細胞與視錐細胞，其中，視桿細胞主要負責暗視條件下感受弱光[3]，視錐細胞主要負責明視條件下的辨色與成像[1-2]。而根據結構的不同，視錐細胞又分為單錐細胞、雙錐細胞和三錐細胞等亞型，其中雙錐細胞較為常見[1]。視桿細胞在視網膜中的結構與數量直接決定了魚類視網膜感光能力的高低，即光敏度[1，4-5]；視錐細胞中含有吸光度不同的視蛋白，特定類型視錐細胞只對特定波長光照敏感，各類視錐細胞以不同數量與比例、排布進行組合直接決定了魚類的辨色與成像能力，即視銳度[1，6-8]。

鱖Sinipercachuatsi是中國特有的名貴淡水經濟魚類，自然條件下終身以活餌為食，白天隱藏在水底，常在晨昏時捕食魚類[9-11]。目前，已有學者對鱖捕食行為中視覺系統作用進行了研究，如Liang等[10]利用行為學試驗證明鱖捕食以視覺為主要感覺；鱖視網膜結構方面已有不少研究，梁旭方[12]利用組織學方法對鱖視網膜各層結構進行了描述，指出其視網膜中含有大量視錐細胞，適宜感受弱光；魏開建等[13]、田文斐等[14]利用組織學方法對鱖視網膜早期發育特征進行了描述，均發現鱖視網膜在發育階段視桿細胞、視雙錐細胞大量增長，并指出這種視覺結構的變化與其從浮游到底棲的生態遷移及捕食方式的變化相適應；Zhang等[15]對鱖視網膜感光細胞層結構進行了研究，對其感光細胞的超微結構分析發現，鱖視桿細胞與視雙錐細胞結構有利于鱖適應暗光下的生活，但發育各階段視錐細胞排布規律較差可能導致其視銳度的下降；Zhang等[15]、魏開建等[13]均指出，在鱖稚魚到幼魚階段(D21～D56，其中下標數值n代表出膜后的時間(d)，記作Dn)的短暫胚后發育時期中，鱖的視覺特點、生活習性均發生了顯著變化，由早期具有趨光性的主動攝食轉變為趨向于暗光下生活的伏擊型捕食，這段特殊的發育時期被稱為鱖的視覺轉變期。

感光細胞是視覺結構的主要組成，感光細胞的發育特點是分析魚類不同發育時期視網膜結構及視覺特點的重要內容。目前，針對鱖視網膜感光細胞層的發育與結構變化的研究較少，有很多內容尚待補充。首先，視桿細胞與視錐細胞在視網膜發育各時期的具體數量變化需要闡明，其次，對發育過程中各類感光細胞(視桿細胞、單錐細胞和雙錐細胞)在視網膜上的密度變化過程的研究尚未見報道，此外，鱖視網膜發育中大量出現的視桿細胞是否影響視錐細胞排布的規律性尚需進行研究。利用組織學方法對鱖視網膜發育中感光細胞進行準確計數較為困難，主要表現為鱖視桿細胞外節細長且輪廓模糊，難以計數，而視單椎、雙椎細胞由于橢球體和外節部分限于觀察角度不同，易將二者混淆。本研究中，基于鱖視網膜明暗適應時感光細胞層的結構變化，利用免疫熒光技術實現了對視桿細胞的計數和單雙錐細胞的識別，對鱖視覺轉變期視桿細胞與視錐細胞的數目增長與分布特點進行了詳細的分析，同時對視桿細胞與視錐細胞排布構建的相關性進行了證明，旨在揭示鱖視網膜感光細胞層的發育過程和特點，為進一步研究鱖適應暗光下底棲生活提供重要資料。

1 材料與方法

1.1 材料

鱖Sinipercachuatsi魚苗取自上海市浦東新區孫農水產養殖場。鱖視桿細胞與視雙錐細胞在D12～D14(體長為9.5～12.5 mm)零星出現，而視桿細胞與視雙錐細胞數量在D23(體長為20～25 mm)以后明顯升高，特別是D28(體長為25～35 mm)以后視桿細胞數量急劇上升，視雙錐細胞大量出現[13，15]，而至D56(體長為85～100 mm)以后視網膜結構已與成魚結構相仿[12-15]。為分析各類感光細胞的生長特點，驗證視桿細胞數量上劇烈增加對視錐細胞排布構建的影響，本試驗中在鱖視覺轉變期均勻地選取3個采樣時間點 (D28、D42和D63)，采樣過程中確保所采樣本在每個特定發育階段的魚苗規格基本一致。視網膜光適應采樣方法同Zhang等[15]，明適應的鱖在自然光下直接取樣，暗適應的鱖在無光條件下暗適應5 h后采樣。

1.2 方法

1.2.1 視網膜組織切片 D28、D42和D63各時期選取規格一致的鱖魚苗5尾，浸入MS-222溶液中麻醉后選取鱖左眼角膜處正上方扎一小孔定位，將樣本頭部固定于2%多聚甲醛溶液48 h。用精密解剖剪將眼球取出，用1×PBS溶液漂洗，在體視鏡下用手術工具剝離多余組織，分離出完整視網膜組織。用梯度乙醇處理視網膜組織(25%→50%→75%→85%→95%，均為體積分數)，在各體積分數的乙醇中均浸泡30 min，最后在體積分數為100%的無水乙醇中浸泡1 min，取出后用二甲苯透明1 min，浸蠟3 h后包埋。利用Leica RM2235切片機以5 μm厚度做視網膜切向切片，用于后續H.E染色、免疫熒光觀察。

1.2.2 組織切片H.E染色 將“1.2.1節”中的視網膜組織切片置于二甲苯中脫蠟2次(15 min×2)，用梯度乙醇復水(100%→95%→85%→75%→50%，均為體積分數)，即在各體積分數的乙醇中浸泡5 min后，將切片置于蒸餾水中5 min，蘇木精染液染15 min；水洗10 min，用體積分數為1%的鹽酸-乙醇浸泡后，蒸餾水沖洗，用質量分數為 0.5%的伊紅液染色1～3 min。再用梯度乙醇脫水，方法與復水時的操作相反，二甲苯處理后，用中性樹膠封片。

1.2.3 免疫熒光 緊密連蛋白(Zonula occluden-1，ZO-1)分布于細胞間貼合面，基于這一分布特征常利用轉基因或免疫熒光手段對其進行熒光標記，其熒光信號可以描繪細胞輪廓與細胞群體排列[16-17]；極性蛋白(Crumbs)在細胞的極性生長與穩定細胞群體排列方面發揮重要作用[18]。本研究中，利用極性蛋白Crb2a (Crumbs家族蛋白成員之一)與緊密黏連蛋白ZO-1在細胞群體中分布的相似性與差異性，對視桿細胞計數及與視錐細胞進行區分。具體操作如下：由“1.2.1節”所得組織切片在室溫下用二甲苯脫蠟(15 min×2)，梯度乙醇復水(體積分數為100%～50%，每個步驟5 min)，磷酸鹽緩沖液漂洗(1×PBS，10 min×2)，PBTX (體積分數0.1% tritonX-100，1×PBS稀釋)抗原修復，然后在室溫下用5%(體積分數)羊血清封閉1 h，4 ℃下一抗孵育過夜，使用的一抗和稀釋液詳見表1。按上述方法漂洗與封閉后，用二抗(體積分數為5%的羊血清稀釋鼠抗IgGHRP 1∶1 000)孵育3 h，浸泡于PBTX中(1×PBS稀釋的Tween-20)，PBS漂洗后，用TSATM加雙熒光素標記二級抗體(表1)，用TSA-F(1∶100，2 h)標記鼠抗IgGHRP，按上述方法沖洗封閉，加入二級抗體(兔抗IgGHRP 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用TSA-T(1∶100，2 h)標記兔抗IgGHRP，PBS沖洗，梯度乙醇復水、封片。圖像采集使用尼康SMZ250熒光顯微鏡或徠卡SP5掃描共焦顯微鏡(Wetzlar，Germany)。

1.2.4 視網膜的光適應與視桿細胞計數 在預試驗中，有光條件下鱖視網膜中視錐細胞外段橢球體緊密地黏附在一起，并將視桿細胞擠壓在狹窄的間隙中，因此，較難對視桿細胞進行區分和計數；相反，在暗適應后，視網膜運動發生，視錐細胞橢球體黏附強度逐漸減弱，視桿細胞分布在視錐細胞擴大的間隙之間，從而在免疫熒光標記的組織切片中可以清楚地識別視桿細胞，同時，也可對單錐與雙錐細胞進行很好地識別(圖1(a)、(b))。此外，鱖視網膜胚后發育過程中視桿細胞和視錐細胞直徑并未出現顯著變化[15]。綜上，在暗適應后對視網膜組織切片進行免疫熒光處理后，使用Image J軟件對視網膜特定區域(100 μm2)的視桿細胞與視錐細胞進行計數。

藍色箭頭示視錐細胞橢球體結構部分； 白色箭頭示雙錐細胞橢球體橫切面；綠色箭頭示單錐細胞橢球體橫切面。The blue arrow is the ellipsoid structure of the cone cell;The white arrow is the ellipsoid cross section of double cone cell；The green arrow is the ellipsoid cross section of single cone cell.圖1 明暗適應下鱖視網膜的結構變化與免疫熒光效果Fig.1 Structural changes and the effect of immunofluorescence in retina of mandarinfish exposed to light and dark adaptation

1.2.5 視網膜分區與數據采集 鱖視網膜不具有中央凹結構，視錐細胞在視網膜中分布雖有區域性，但整體較為均勻[13，15]。故本試驗中將視網膜分為4區(D-N,背-鼻區; D-T，背-顳區;V-N，腹-鼻區; V-T，腹-顳區)，同時視網膜邊緣有一狹窄的生成帶，均為感光細胞前體，形態不易區分，本研究中未做討論(圖2)。特定發育階段選取5片完整視網膜，在每片視網膜各區域隨機采樣5次，各區域不同時期各獲得16個左右的樣本數，進行后續桿細胞數和對應Q4值的統計分析。

N—鼻側； D—背側； T—顳側； V—腹側； D-N—背-鼻區； D-T—背-顳區； V-N—腹-鼻區； V-T—腹-顳區； 藍色窄帶示視網膜發生區；左下角示鱖魚方向與視網膜方向的對應關系。N—nose side; D—dorsal side; T—temporal side; V—ventral side; D-N—dorsal-nose side; D-T—dorsal-temporal side; V-N—ventral-nose side; V-T—ventral-temporal side; the blue narrow band shows the germinal zone of retina;the lower left corner shows the direction correspondence between mandarinfish and retina.圖2 視網膜分區Fig.2 Division on retina

1.2.6 視錐細胞排布規則性的定量分析 引入Q4值作為衡量細胞排布規則性的參數，具體算法參照Salbreux等[17]的方法：Q4=0時表示單個細胞相對于其周圍細胞排列完全隨機，區域細胞群體平均Q4=0時表示細胞總體平面排列完全隨機；相反，Q4=1時表示單個細胞相對于外周細胞嚴格標準化排列，而區域細胞群體平均Q4=1時則表示細胞群呈現出完美的平面排列?；贛ATLAB (R2018b)軟件(MathWorks，Natick，USA)計算所選圖像中視錐細胞群體的Q4值。

1.3 數據處理

試驗數據均采用單因素方差分析和最小顯著性差異多重比較法進行處理。試驗數據以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，數據處理使用IBM SPSS 22 軟件(Armonk，NY，USA)完成，顯著性水平設為0.05。

表1 試驗用抗體和熒光顯色劑信息Tab.1 Informations on antibody and fluorescent chromogenic agent in this study

2 結果與分析

2.1 視覺轉變期視桿細胞數量的增長特點

從圖3(a)、(b)可見：鱖視覺轉變期視網膜各區域視桿細胞數均出現顯著增長，且各區域D28、D42、D633個時期間均有顯著性差異(P<0.05)；視網膜腹側(V側)視桿細胞數量最多且增長快，如腹-鼻區中100 μm2內視桿細胞數，D28時期為473±178，D42時期為3 101±876，而D63時期已達5 505±1 103；視網膜背側(D側)視桿細胞數量在D28、D42、D63時期也出現了顯著增長，數量略小于腹側，但也積累到了較高的數量，如背-顳區中100 μm2內視桿細胞數在D63時期已達5 135±820；發育過程中，視桿細胞在視網膜全區域生長較為均勻，各時期視網膜腹側與背側視桿細胞的數量無顯著性差異(P>0.05)。

從圖3(c)可見：視桿細胞與視錐細胞之比(R/C)在整個視覺轉變期發生了劇烈變化，且視網膜各區域D28、D42、D633個時期間均有顯著性差異(P<0.05)；視網膜各區域均表現為視桿細胞逐漸占據感光細胞的主體，如背-顳區中，D28時期R/C平均值為4.3±0.4，而D63時期已上升到42.3±10.6。這種R/C值的顯著變化不僅說明同一時期視桿細胞與視錐細胞數量組成情況，也反映出這一時期視桿細胞遠高于視錐細胞的增長速度。另外，視網膜各區域D28時期R/C值均未出現顯著性差異(P>0.05)，但到D42、D63時期，背側的背-鼻區與背-顳區R/C值均顯著高于腹側的腹-鼻區與腹-顳區 (P<0.05)，這也說明視錐細胞在視網膜胚后發育中逐漸出現區域化，腹區視錐細胞數量逐漸高于背區。

2.2 視覺轉變期視錐細胞的增長特點

鱖視覺轉變期視錐細胞數量的變化較為獨特，其中單錐細胞數量在整個發育時期呈現出下降趨勢，且視網膜各區域D28、D42、D633個時期間單錐細胞數均有顯著性差異(P<0.05)(圖4(a))，而雙錐細胞數量則呈上升趨勢，且視網膜各區域D28、D42、D633個時期間雙錐細胞數均有顯著性差異(P<0.05)(圖4(b))；雙錐與單錐細胞數之比(DC/SC)隨發育時間的延長明顯上升，視網膜各區域D28、D42、D633個時期間DC/SC值均有顯著性差異(P<0.05)(圖4(c))。以背-顳區為例，100 μm2內，隨發育時間的延長單錐細胞數量逐漸減少，D28時期為 31±6，D42時期為15±9，D63時期減少至8±3，雙錐細胞數量顯著提高，D28時期為74±17， D42時期為88±21，D63時期增加至103±17，D28、D42、D63時期DC/SC值分別為2.4±0.3、5.72±0.9、12.8±1.9。

單錐細胞數量在整個視覺轉變期平緩下降，而雙錐細胞數增長速度在D42～D63時期明顯高于D28～D42時期，如D63時期的背-顳區中DC/SC值已達到12.8±1.9，而在DC/SC值較低的腹-鼻區中D63時期數值也達到了6.5±1.1(圖4(c))。

在D63階段，背-鼻區與背-顳區的DC/SC值無顯著性差異(P>0.05)，腹-鼻區與腹-顳區的DC/SC值也無顯著性差異(P>0.05)，而背側(背-鼻區和背-顳區)與腹側(腹-鼻區和腹-顳區)的DC/SC值存在顯著性差異(P<0.05)，這說明D63時期腹側單錐細胞較背側多，而在D28和D42時期視網膜各區的DC/SC值變化同D63時期，只是沒有D63時期DC/SC值變化大(圖4(c))，這說明處于視覺轉變期的視錐細胞群體中，雙錐細胞生成速度明顯快于單錐細胞，對各時期一定區域單錐與雙錐細胞的統計結果也從側面證明了這點。

2.3 視桿細胞與視錐細胞排布的相關性

為分析鱖視網膜中視錐細胞間隔處視桿細胞的數量變化是否影響視錐細胞排布，對視網膜不同區域100 μm2內的視桿細胞進行計數。首先對特定時期視網膜各區域感光細胞層進行分析。在D63時期，Crb2a蛋白在視桿細胞和視錐細胞輪廓上有明顯的標記，其中在雙錐細胞間隔的窄縫中分布較少，大部分分布在細胞間隔處；同時，在錐體細胞間隔處混合了大量的視桿細胞 (圖5)。視網膜各時期各區域視桿細胞數與對應視錐細胞排布的平均Q4值如圖6所示，如D63時期背側和腹側的平均Q4值分別為0.69(n=15)和0.62(n=16)，背側和腹側的視桿細胞數未隨Q4值的變化出現明顯浮動(圖6E、F)，D28、D42時期的視桿細胞數與Q4值的關系也與D63時期相似(圖6A～D)。結果表明，在特定發育階段，視錐細胞間隙的視桿細胞數量與視錐細胞排布規律性無明顯相關性。

標有不同小寫字母者表示同一區域不同時期間有顯著性差異(P<0.05)，標有不同大寫字母者表示同一時期不同區域間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。Means with different small letters are significant difference in different developmental periods in the same region (P<0.05)，means with different capital letters are significant differences in different regions with the same developmental period (P<0.05)，and means with the same letters are not significant difference between groups (P>0.05)， et sequentia.圖3 鱖視覺轉變期視桿細胞增長特點Fig.3 Growth characteristics of rod cell in mandarinfish during visual transition period

圖4 鱖視覺轉變期視錐細胞增長特點Fig.4 Growth characteristics of cone cells of mandarinfish during visual transition period

圖5 特定時期視網膜視錐細胞排布特點 (以D63為例)Fig.5 Arrangement characteristics of cone cell mosaic in specific period (i.e.D63)

圖6 各時期特定區域視桿細胞數與對應視錐細胞排布的平均Q4值的關系Fig.6 Relationship between the rod cell number and the mean Q4 value of cone cell mosaic in each period

在D28時期，視桿細胞以較低密度分布在視錐細胞狹窄的間隙中，在D28～D63時期，視錐細胞間隙的視桿細胞數量急劇增加(P<0.01)(圖3(a)，圖7(a))；各時期視桿細胞的顯著增加并不影響視錐細胞排布，主要表現為平均Q4值無明顯變化(P>0.05)(圖7(b))。這也說明，在不同發育階段，視桿細胞數量的急劇增加與視錐細胞排布的規律性無直接關系。

3 討論

3.1 鱖視覺轉變期視網膜中視桿細胞的變化

本研究表明，鱖視桿細胞數量在視覺轉變期出現劇烈增長，這與晝間活動魚類的視網膜結構有明顯不同，如斑馬魚視桿細胞數量較少，且終身維持在一定范圍內[6，17，19]。同時，鱖視網膜神經節細胞在胚后發育過程中增長緩慢[13-15]，大量視桿細胞與下游較少神經節細胞所組成的高度匯聚感受野是增強魚類視網膜感光能力的關鍵因素之一[1，3]。本試驗中，鱖視網膜胚后發育時期視桿細胞的大量出現，由視桿與視錐細胞數量的比值可以看出，視桿細胞在鱖視覺轉變期及后續發育階段將占據感光細胞的絕對主體。推測鱖D63時期，視桿細胞與神經節細胞匯聚程度增高，這種結構極大增強了鱖視網膜對于光線的敏感性。視桿細胞急劇增長也與此階段鱖生活習性、捕食習性的變化相對應，主要表現為鱖視網膜感光能力增強，鱖苗逐漸畏懼強光，趨于暗光下活動[9,12]。

標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有不同大寫字母者表示組間有極顯著性差異(P<0.01)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different small letters being significantly different at the 0.05 probability level, the means with different capital letters are significantly different at the 0.05 probability level， and the means with the same letter are not significant differences.圖7 各時期視桿細胞平均數量與視錐細胞排布的平均Q4值Fig.7 Average rod cell number and the mean Q4 of cone cell mosaic in each period

3.2 鱖視覺轉變期視網膜中視錐細胞的變化

本研究中視覺轉變期，鱖視網膜中雙錐細胞逐漸占據了視錐細胞的主體。而雙錐細胞的大量出現被認為是魚類視網膜增強其感光能力的適應性結構變化，主要表現為視錐細胞與下游神經節細胞而言逐漸失去了一對一的精確對應關系，辨色能力與成像能力下降，而出現視錐細胞與下游神經節細胞多對一的關系，視錐細胞相對下游神經節細胞匯聚程度增加[1，3]。本研究中D28時期以后，雙錐細胞的顯著增加與單錐細胞的緩慢增長造成視錐細胞種類的單一化，可能造成鱖視網膜胚后發育過程中辨色能力逐步下降。

魚類視網膜視錐細胞的區域密度與組成直接決定了視網膜在各個方向上的成像能力[20-21]。本研究中，鱖視網膜腹側單錐細胞數量高于背側，D42～D63時期腹側雙錐與單錐細胞數量的比值逐步低于背側，D42時期以后鱖視網膜腹側單錐細胞含量較多，視錐細胞種類較背側豐富。這表明鱖視網膜腹側的成像能力與辨色能力應高于背側，這也與鱖逐漸營底棲生活捕食水體上層魚類的捕食習性相對應[12-15]。

3.3 鱖視網膜中視桿細胞發育對視錐細胞排布構建的影響

分化中的視桿細胞與視錐細胞來源于不同的祖細胞[22-23]，同時，視桿細胞出現在視錐細胞間隔處的時間比視錐細胞排布形成的時間晚[17，19]。晝間活動的斑馬魚視網膜發育中，視桿細胞對視桿細胞排布的形成并無明顯影響[17，19]，本研究結果與上述研究結論一致。同時，本研究中提供了新的結論，表明在視網膜發育過程中視桿細胞在視錐細胞排布形成過程中無影響，特別是在一些類似鱖這樣棲息于暗光下視網膜中具有豐富視桿細胞的魚類中，視網膜發育過程中視桿細胞數量的急劇增加并不影響視錐細胞排布的形成。簡而言之，鱖視桿細胞數量的增長對視錐細胞排布形成幾乎無影響。這也說明在視覺轉變期，鱖視網膜趨向于增強感光能力的結構變化過程中，視桿細胞的大量增生并不會影響鱖的視銳度，這使得鱖在視覺轉變期中視網膜的結構既適應了暗光感受，又保證了基本的成像能力。

4 結論

1)通過對鱖視覺轉變期視網膜中感光細胞發育特征的分析，發現鱖視覺轉變期視網膜感光細胞層在結構上發生了劇烈變化，各類感光細胞數量與比例變化明顯。

2)視桿細胞在視網膜各區域均勻增長，視錐細胞區域化增長，其中腹側增長速度明顯快于背側，兩個發育過程相互獨立，共同為其底棲暗光生活的視覺轉變提供結構基礎。