基因編輯CRISPR技術在海洋生物遺傳育種的應用進展

于笛，遲小妹，，滕煒鳴，謝璽，趙沖，王慶志*

(1.遼寧省海洋水產科學研究院 大連市海產貝類種質資源創新利用重點實驗室，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023)

基因編輯(gene editing)技術是指在基因組水平進行基因的定點插入/缺失突變、敲除、多位點同時突變和小片段刪除等精確操作技術。通過對基因編輯技術的研究，可以幫助人類探索生命本質，揭開疾病發生之謎，尋求疾病預防與治療的有效途徑[1]。基因編輯的最初技術手段為同源重組介導的基因打靶技術(gene targeting)，該技術雖可以準確對特定基因進行修飾，但在實際操作中存在效率低、耗時長且可能導致基因突變等問題，影響了該技術的實際應用。近些年，基因編輯技術蓬勃發展，相繼誕生了包括鋅指核酸內切酶(zinc finger endonucleases, ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和規律成簇短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)等高效基因編輯工具。其中，CRISPR技術是當前應用最廣泛的基因編輯技術之一。2012年至今，世界已發表數千篇關于CRISPR的文章，該技術還于2013年和2015年先后被《Science》雜志評為全球十大科技突破之一，于2020年獲得諾貝爾化學獎。

海洋是人類不斷探索的資源寶庫，海洋中的許多生物如魚、蝦、貝、藻等經濟種類更是人類餐桌上的美味佳肴，然而，隨著過度捕撈、海洋環境污染等問題日益加劇，海洋生物數量不斷減少，保護海洋生物的任務迫在眉睫，將傳統的正向遺傳學應用于海洋生物遺傳育種研究更是困難重重。

作為時下生命科學領域最前沿的技術之一，基因編輯技術在生物基因功能研究、動植物病害防治及品種改良、遺傳疾病基因治療等諸多領域展現出廣闊的應用前景。目前，該技術已經在許多模式生物、重要經濟動植物乃至人類胚胎發育研究中取得一定突破[2-10]。2020年，基因編輯技術在淡水養殖魚類中取得突破進展，成功培育出生長速度快、肉質質量高和規格大的新品系黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco等[11]。近年來，CRISPR等基因編輯技術應用于海洋生物的相關研究已有一些報道[12-13]，已成功應用該技術進行遺傳育種研究的物種有玻璃海鞘Cionaintestinalis[14-15]、海七鰓鰻Petromyzonmarinus[16]、海葵Nematostellavectensis[17]、海膽Strongylocentrotuspurpuratus[18]、三角褐指藻Phaeodactylumricornutum[19]和大西洋鮭Salmosalar[20-21]等。本文主要綜述了基因編輯技術的發展建立、作用機制及其應用現狀，并結合海洋生物基因功能研究領域的研究進展，探討了基因編輯技術在海洋生物資源保護與開發、遺傳育種等領域的廣泛應用及發展前景。

1 ZFN和TALEN技術

1.1 ZFN

基因編輯本質上是利用限制性核酸內切酶對生物遺傳序列進行修飾，并產生穩定的突變型。這里的修飾包括插入/缺失突變、敲除、多位點同時突變和小片段刪除等。然而，由于天然核酸內切酶的種類有限，科學家們迫切希望找到新的基因編輯方法。ZFN是由Kim等[22]成功構建的第一種人工核酸酶，目前，該技術已在多種模式生物中實現了靶基因的敲除或定點修飾[23-26]，并于2005年實現了人類細胞的基因敲除[27]。由于ZFN對于其作用的靶點DNA序列無特異的對應性，該技術需要通過構建龐大的鋅指表達文庫來篩選出能夠特異識別這些靶點的鋅指蛋白。此外，由于ZFN序列識別的特殊性，目前仍無法設計出滿足任意一段序列要求的ZFN，也無法確保每個基因都能夠找到適合的ZFN作用靶點[28]。

1.2 TALEN

Moscou等[29]首次提出了一種類轉錄激活因子效應蛋白(TALE)，該蛋白具有特異結合宿主基因的功能[30]。此后，以TALE為DNA結合域構建的TALENs技術在多個物種的基因修飾研究中均得到了成功應用，該技術被《Science》雜志評為2012年度十大科學進展之一[31]。TALENs技術的作用機制與ZFNs技術類似，其核心是識別特異DNA序列的TALEs蛋白和核酸內切酶FokI。TALEs蛋白是植物病原黃單胞桿菌Xanthomonascampestris進入植物細胞改變基因序列后轉錄翻譯分泌的一類類似于真核生物轉錄因子的TALE蛋白家族，該家族首次發現的為AvrBs3[32]，由12個或以上特異性識別DNA序列的串聯“蛋白模塊”和N′端、C′端兩側的序列組成。每個“蛋白模塊”由34個氨基酸組成，其中，第12和第13位點是靶向識別的關鍵位置，即重復可變的雙連氨基酸(repeat variant diresidue，RVD)位點。TALEs蛋白上的每個RVDs只能識別1個堿基(A、G、C、T)，即NI識別A，NG識別T，NN識別G或者A，HD識別C[33-35]。此外，在構建模塊時，研究人員發現，NK識別G的特異性比NN要好，但由于NK活性較低，更傾向于使用NN[29,36]。由于不同物種基因組大小不同，選擇的特異序列長度也不同，對于哺乳動物的基因修飾，識別靶點一般選取16～20 bp的DNA序列。

TALEs蛋白是識別靶基因，而FokI的作用則是切割DNA。FokI是一種核酸內切酶，必須形成二聚體才具有活性，所以大大減少了隨機酶切的概率。TALEs蛋白和FokI連接成重組蛋白表達1個重組核酸酶，識別靶點核酸序列，發揮內切酶的活性，從而切斷目的基因，實現基因敲除。然而這些方法在操作上技術難度大、耗時費力、費用昂貴且效率并不高[37-38]。

2 CRISPR編輯技術

CRISPR是細菌和古細菌自身的一種獲得性免疫系統，通過特異性RNA介導相應的內源蛋白對侵入DNA進行特異性切割降解。1987年，日本學者Ishino等[39]在對大腸桿菌EscherichiacoliK12克隆時發現了一系列相互間隔的短回文序列，并于2002年被正式命名為規律成簇短回文序列。CRISPR系統主要包括一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效應蛋白(如Cas9、Cpf1等)的編碼基因和一段成簇的短回文序列組成，CRISPR系統因組分不同可以分成2類5型共16種亞型[40-41]。1類包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，2類包括Ⅱ型和Ⅴ型。前3種發揮功能時需要利用多個效應蛋白復合物干擾靶基因，而另兩種則只需單一的效應蛋白干擾靶基因即可發揮作用。

2.1 CRISPR/Cas

目前，研究最深入的CRISPR系統為CRISPR/Cas9(CRISPR associated gene 9)。CRISPR/Cas系統是一種RNA介導的適應性免疫系統，存在于大約48%的細菌和95%的古細菌中，可提供序列特異性保護以抵抗外來的DNA甚至RNA。2012年，Jinek等[42]將CRISPR/Cas9系統中的crRNA和tracrRNA改造成一條單導向RNA(single-guide RNA, sgRNA)，它能夠指導Cas9蛋白對指定DNA序列進行靶向斷裂，這為CRISPR/Cas9系統的進一步應用奠定了基礎。2013年，麻省理工學院Mail等[43]和哈佛大學Li等[44]首次實現了CRISPR技術在真核生物基因定點突變領域的突破，由此開始將CRISPR技術應用到基因編輯中。同年，來自不同地區的研究團隊先后證實了CRISPR/Cas9系統在哺乳動物中的可行性和初步應用研究情況[44-45]。由于CRISPR/Cas9系統只需對sgRNA進行設計，因此，具有操作簡單和節省時間等優點。

2.2 CRISPR-Cpf1

2015年，隨著基因編輯技術的發展進步，華裔科學家張鋒帶領的小組發現了新一代基因編輯方法，這種新方法與CRISPR/Cas9較為相似，被稱為CRISPR-Cpf1技術，這是一種更為高效的CRISPR系統[46]。與Cas9相比，Cpf1蛋白更加簡潔且易于操作，這種蛋白僅需要一段crRNA即可構成切割復合體，進而完成對目的DNA片段的切割。這種新的蛋白切割后產生的末端為黏性末端，有利于目的基因以非同源重組的方式插入靶向位點，在克服了Cas9蛋白的缺陷后，CRISPR-Cpf1系統成為目前最有效的基因編輯方法。作為全新的基因編輯方法，CRISPR-Cpf1系統中的Cpf1蛋白主要有3個類別：氨基酸球菌Acidaminococcussp.BV3L6、土拉熱弗朗西斯菌FrancisellanovicidaU112和毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium ND2006，分別簡寫為 AsCpf1、FnCpf1和 LbCpf1。

CRISPR-Cpf1系統與CRISPR/Cas9系統的作用原理類似，Cas9系統集中在提高其特異性上，主要改造針對Cas9自身，諸如改變Cas9蛋白的結構，給其融合一個DNA結合域或者FokI核酶等；相比Cas9，Cpf1有許多超過Cas9的優點，如序列短，可用于包裝腺病毒等，但對其研究相對較少，Moon等[47]提出，crRNA識別20個靶DNA且3′端加幾個U可以提高Cpf1系統的在靶率，這為Cpf1提供了新的發展方向。

目前，隨著基因編輯技術的不斷發展，新的應用手段也在不斷開發，如Co-CRISPR等技術的出現，為基因編輯技術的開發與應用展現了更廣闊的前景。

3 基因編輯技術在海洋生物遺傳育種中的應用

海洋生物能夠為人類提供豐富的優質蛋白，開展海洋生物尤其是海水養殖品種的基因功能研究，通過揭示其遺傳生長規律，以及培育高產、抗病和抗逆品種，不僅具有重要的科學意義，還可有效提高水產養殖業的經濟效益。近年來， 隨著全基因組測序工作成本的降低，水產生物后基因組時代到來，魚、蝦、蟹、貝、藻等諸多水產經濟品種的基因組已被測序，為基因編輯在水產養殖物種中的應用提供了豐富的遺傳信息資源。 CRISPR技術在海洋生物中的應用也從模式生物開始，該技術最早在斑馬魚Daniorerio、玻璃海鞘等模式動物中實現。與其他技術相比，CRISPR技術在模式生物中普及后開始迅速應用于非模式生物中。這從一方面反映了此項技術的普遍適用性和高效性，從另一方面也為海洋生物的研究帶來了前所未有的機遇。新型基因編輯技術不僅可以敲除基因，還可以定向編輯目的基因，能夠顯著縮短育種時間，與傳統的轉基因技術相比也更加安全。CRISPR技術在不同水生生物類群中的研究進展參見表1。

3.1 魚類

相對于其他物種，基因編輯技術在魚類中的研究較為廣泛， 該基因編輯技術迄今已在斑馬魚、青鳉Oryziaslatipes等模式魚類和其他水產經濟魚類遺傳育種中建立了不少應用。 相對于小鼠等模式生物，斑馬魚的胚胎在顯微鏡下觀察是透明的，可以看到各個器官和血管的發育。斑馬魚體外受精，繁殖周期短并與人類的器官高度相似，因此，該魚已經成為生物醫學研究的一個重要模型。

2013年，利用CRISPR技術實現了對斑馬魚fh基因的敲除并獲得了成功[48]。研究證明，CRISPR/Cas9系統在斑馬魚體內可誘導胚胎中的靶向基因修飾，其效率與ZFN和TALEN的作用相似。2015年，研究者利用CRISPR技術成功實現了對海七鰓鰻中與人類同源的tyr基因的敲除，結果顯示，海七鰓鰻完全適應CRISPR技術且提高注射量能夠成倍地提高其突變量[16]。2017年，研究者利用CRISPR技術對斑馬魚的atplala.1、atplala.2、atplala.3、atplala.4、atplala.5、pkd2、aqp3a、bmper、s12a、tbx2a等10個前腎表達基因進行敲除，經過三代的篩選發現只有atplala.2和pkd2能夠使斑馬魚胚胎發育缺陷[49]。同時該研究敲除了斑馬魚faf1基因，faf1基因參與早期胚胎的神經嵴細胞遷移分化，通過顯微注射敲除該基因后斑馬魚的色素沉積延遲及尾部肌節部出現“結節樣”變化[50]。

2019年，研究者成功通過CRISPR技術建立了青鳉foxl2基因缺失的突變體，foxl2突變體有遺傳雌性、生理雄性的表型特征，結果表明，foxl2對維持青鳉性腺功能具有重要作用[51]。Nanog基因作為誘導多能性干細胞關鍵因子之一，對胚胎早期發育和維持胚胎干細胞全能性具有重要作用。CRISPR/Cas9系統可以高效率敲除青鳉tyr基因和nanog基因，且通過同源重組機制也可介導青鳉nanog基因敲入[52]。該技術還可以敲除青鳉的SLC45a2基因，產生的突變體顯示出白化病表型[53]。

在研究大西洋鮭身體著色的關鍵基因slc45a2和tyr過程中，首次利用CRISPR技術對海洋冷水物種進行了敲除[20]。在隨后的研究中，研究者利用Co-CRISPR技術同時靶定著色基因與一些不相干的基因，使得缺失著色基因的大西洋鮭的突變體更加容易被識別，而且第二個被靶定的基因擁有較高的突變率[21]。

除此之外，CRISPR技術在牙鲆Paralichthyolivaceus生長發育方面的應用也取得了一定進展，研究者采用CRISPR技術對牙鲆肌生成抑制素(MSTN)進行干擾，將靶向MSTN基因第一個外顯子的Cas9 mRNA和sgRNAs共注射到牙鲆胚胎中，通過篩選，在F1代中得到了具有MSTN干擾的雜合雙等位基因突變體，表現為身體增厚，肥滿度增加[54]。

3.2 甲殼動物

目前，甲殼類動物中CRISPR技術的相關研究主要涵蓋蝦類和大型溞Daphniamagna。2014年，Nakanishi等[55]利用CRISPR技術將遺傳突變引入到大型溞的內源盲基因中，這是該項技術在甲殼動物中的首次應用。研究者失活了大型溞的pax6基因，證明了該基因在眼發育中的關鍵作用。除此之外，研究者還將基因編輯后的個體繼續培養至性成熟，并對獲得的后代進行檢測，發現這些編輯過的基因組能夠順利遺傳給后代。

2016年，研究者利用CRISPR技術在夏威夷明溝蝦Parhyalehawaiensis中成功實現了對Hox基因的定點敲除，結果表明，特定的Hox基因直接決定了甲殼動物頭胸腹部不同形態的附肢形態[56]。這也使得CRISPR技術在經濟甲殼動物(如蝦蟹類)中的應用探索也有了突破。同年，研究者利用CRISPR技術成功實現了經濟蝦類脊尾白蝦Exopalaemoncarinicauda中幾丁質酶基因Chi4的敲除，同時觀察到Chi4敲除對脊尾白蝦生長發育的影響，若對更多的基因進行改造，可能會獲得更高產率的新品種[57]。在此基礎上，通過共注射體外轉錄的Cas9mRNA和gRNA的方法敲除脊尾白蝦的MIH基因，能夠獲得幼體發育時間縮短的個體[58]。

3.3 軟體動物

CRISPR技術在軟體動物中的研究相對較少。2015年，研究者利用CRISPR技術在大西洋角螺Crepidulafornicata幼蟲中檢測到了具有紅色熒光信號的β-catenin蛋白[59]。2019年，一個基于核糖核酸蛋白復合物的太平洋牡蠣Crassostreagigas基因編輯系統被開發出來[60]。在靶基因中，肌生成抑制蛋白(MSTN)和Twist被選為靶點，CRISPR誘導的突變主要是1～24 bp的小突變，這種方法為牡蠣和其他海洋雙殼類的基因功能提供了強有力的工具，并有可能作為一種新的基因工程技術用于養殖并改善牡蠣的特性。

3.4 棘皮動物

在海洋棘皮動物的CRISPR技術相關研究方面，多個學者都針對海膽的基因進行了編輯。2016年，研究者利用CRISPR技術將靶向Nodal基因的sgRNA和編碼Cas9蛋白的mRNA注射到海膽的受精卵中, 成功敲除了海膽的Nodal基因, 在全部6種gRNA中有5種出現了預期的敲除效果[18]。同年，研究者通過將目標對準一個非必需基因簡化gRNA的構建步驟，該基因能快速評估胚胎中成功的CRISPR功能，從而能夠簡單目測出功能基因的破壞[63]。2019年，Lin等[61]詳細介紹了CRISPR技術在海膽胚胎中的應用方法，包括gRNA設計、體外合成單導向RNA (sgRNA)、CRISPR技術在基因敲除和單核苷酸編輯中的應用，以及用于評價基因編輯效率的合成胚胎的基因分型方法。2019年，研究者將海膽中的Pks1基因成功敲除，結果表明，在海膽變態后的幼體中仍然保留了白化型，能夠存活至少一年并發育為白化的成年海膽[64]。

3.5 其他

2014年，研究者開始使用CRISPR技術實現對玻璃海鞘基因的定點敲除[14]，為了敲除玻璃海鞘中的Hox基因，研究人員選取了Hox3、Hox5、Hox12 3個等位基因共計8個靶點，結果發現，Hox3-sg3、Hox5-sg1能使受體目的基因產生突變，其余并未出現預期效果。進一步研究發現，導入的sgRNA表達框架質量必須大于1.5 pg，表達Cas9蛋白mRNA的質量必須大于15 pg，才能使受精卵發生突變，且突變率與使用量成正比。另一個研究選取了玻璃海鞘發育過程中非常重要的ebf基因作為靶向基因，并以其為基礎構建了2個gRNA表達載體，將靶向ebf基因的gRNA與編碼Cas9蛋白的mRNA以電穿孔的方式導入受精卵中，取得了較高的突變效率[15]。通過改造載體上的部分序列，試驗還達到了幫助細胞中質粒轉錄的效果。

2014年，研究者分別利用CRISPR和TALEN技術對海葵Nematostellavectensis的一種內源的紅色熒光蛋白(FP-7R)進行了敲除，被敲除基因的海葵不能發出紅色熒光，該研究還證明了FP-7R并不是海葵發育所必需的[17]。2016年，CRISPR技術的應用領域拓展到了海洋藻類中，三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum中的CpSRP54基因被成功敲除[19]，該研究也證實，CRISPR技術可以在微藻中有效地產生穩定的靶向基因突變。2019年，研究者通過CRISPR/CAS9誘變基因編輯對海蠕蟲Capitellateleta橫紋肌視蛋白基因r-opsin1進行了破壞，雖然突變個體眼斑感光細胞和相關色素細胞正常形成并持續存在，但幼蟲的趨光性顯著下降[62]。

4 存在問題及展望

近年來，CRISPR系統和相關蛋白的研究不斷地完善和優化，為整個生物技術領域提供了無限可能。相對于ZFN和TALEN這兩種基因編輯技術，CRISPR/Cas作為第三代人工核酸酶成為目前研究的熱點，在技術門檻、應用便捷程度、成本等關鍵方面具有顯著的優勢。然而，從目前的報道來看，CRISPR技術在研究與應用過程中仍存在諸多問題：

1) 應用受限：基因編輯技術主要是通過顯微注射等方法對細胞系或胚胎進行操作，而海洋生物細胞系較少，一定程度上限制了基因編輯技術的應用，目前的研究只限于模式生物和少數海洋生物，廣泛應用任重而道遠。

2) 編輯效率和精確度不高：研究及應用中可能產生脫靶問題，引起基因組的重排或無法預測的突變，已有報道改良后的基因編輯技術在降低脫靶率和增強特異性等方面均取得了顯著進展[65-66]。

3)公眾認知度不高：多數公眾對于CRISPR技術的發展、研究及應用的了解不多，對于基因編輯的水產品安全性存在一定的疑慮。

隨著海洋生物基因組研究的快速發展，CRISPR技術也為海洋生物，特別是水產養殖領域的研究帶來了前所未有的機遇。CRISPR技術通過高效、定向地編輯目的基因，進行基因的切除與導入，未來將對海洋生物的遺傳育種產生深遠影響，建議今后應在以下幾方面開展更多研究工作：

1)擴大研究和應用范圍：相對于其他物種，CRISPR技術在海洋生物領域的研究較少且多集中在魚類，未來應在更多海洋經濟品種中更深入和廣泛地展開遺傳育種的研究與應用。

2)提高基因編輯的效率和精確度：通過對基因更精準和高效的敲入/敲除或修飾，提升水產苗種的繁育效率和繁殖力、提高生長速度、增強抗逆性與抗病性，獲得具有優良性狀的新品種，實現經濟與社會效益的雙贏。

3)深入解析海洋生物基因功能：隨著更多海洋生物基因組測序的完成，基因編輯技術將進一步解讀不同基因在海洋生物遺傳育種乃至生物進化發育中的作用。

4)提高透明度和公眾認知度：一項技術的成功應用，推廣也是其中重要一環，研究者應該讓基因編輯技術的使用更透明，而管理者則應該不斷完善政策和監管，從而減少公眾的質疑，獲得消費者的認可，使該技術理性健康發展，更好地服務于大眾。