脂類去除對赤道外海莖柔魚軟組織穩定同位素的影響

劉娜，劉必林，2，3，4*

(1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306； 2.國家遠洋漁業工程技術研究中心，上海 201306； 3.大洋漁業資源可持續開發教育部重點實驗室，上海 201306； 4.農業農村部大洋漁業開發重點實驗室，上海 201306)

莖柔魚Dosidicusgigas廣泛分布于東太平洋，是重要的大洋性經濟頭足類之一，其既是東太平洋最重要的捕撈對象，同時也在中上層海洋生態系統中扮演著關鍵角色[1]。作為東太平洋最重要的漁業資源之一，隨著其資源不斷被開發，國內外學者對其關注度也在不斷攀升。20世紀90年代以來，各國學者對莖柔魚的年齡、生長、種群、繁殖、漁場及資源等方面做了大量研究工作[1-5]，但對莖柔魚攝食生態學研究相對較少。

在生態系統研究中，由于構成消費者組織成分的穩定同位素與其食物相關，故穩定同位素已成為一種有效研究生態系統中物質和能量流動的方法，為研究海洋生物營養狀況和遷徙模式提供了重要途徑[6-7]。碳穩定同位素比(δ13C)從食物到消費者變化較小，但是在基礎的生產者中存在差異，因此，其扮演了碳源的示蹤者角色[8]。氮穩定同位素比(δ15N)從食物到消費者的營養富集度為3.0‰～4.0‰，可用來代表消費者的營養級[8-9]。頭足類軟組織中含有較多的蛋白質和脂類，具有豐富的碳氮元素，是穩定同位素分析常用材料，對這些組織中碳氮穩定同位素的分析是研究海洋生物洄游路徑和棲息環境的重要手段，但是脂類的存在會導致穩定同位素測定產生一些偏差，而由此造成的影響在頭足類中的研究較少[10]。另外，生物體不同組織間周轉率存在差異，即在消費者組織中反映其食物來源穩定同位素值所需的時間不同，因此，研究穩定同位素含量在不同組織中的差異非常重要[11-13]。本研究中，通過比較去脂前后赤道莖柔魚軟組織中碳氮穩定同位素的差異，從而分析了脂類對軟組織穩定同位素含量的影響，旨在為進一步開展莖柔魚的攝食生態研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年12月—2018年2月從10個站位(圖1)共采集莖柔魚樣品500多尾，隨機挑取62尾(胴長為195～324 mm，表1)分別提取60個胴部肌肉樣品、18個性腺樣品和54個消化腺樣品(-17 ℃下冷凍保存)，用于軟組織穩定同位素分析，由于性成熟度較低，故性腺樣品收集較少。

表1 樣本基礎信息Tab.1 Sample basic information

圖1 莖柔魚樣品采集站位Fig.1 Sampling stations of jumbo flying squid Dosidicus gigas

1.2 方法

1.2.1 脂類去除 將軟組織樣品用超純水清洗后放入冷凍干燥機內冷凍干燥(-55 ℃，干燥24 h以上)，干燥后的樣品用MM400混合型球磨儀(RetschGmbH，Haan，Germany)研磨1.5 min至粉末；稱取樣品粉末200 mg加入12 mL三氯甲烷-甲醇溶液中(體積比為2∶1)浸泡24 h，以4 000 r/min離心3 min，取出上清液；再次加入3 mL三氯甲烷-甲醇溶液中(體積比為2∶1)，震蕩2 min混勻，以4 000 r/min離心3 min,取出上清液，此過程再重復一次；最后將取出的上清液樣品放入烘箱中(65 ℃)烘干3 h，烘干后的樣品再次用球磨儀研磨至粉末。

1.2.2 穩定同位素的測定 稱取1.0～1.5 mg樣品粉末用鋁箔包被后送入儀器，使用ISOPRIME 100穩定同位素質譜儀(Isoprime Corporation，Cheadle，UK)和Vario ISOTOPE cube元素分析儀(Elementar Analysensysteme GmbH，Hanau，Germany)測定碳氮穩定同位素。計算公式為

δX=(Rsample/Rstandard-1)×103。

其中：X為13C或15N；R為相應的比例，如13C/12C或15N/14N；δ為同位素組成的代名詞，如δ13C、δ15N分別為碳和氮穩定同位素相對于各自標準物的比值，可代表碳氮穩定同位素值。

1.3 數據處理

試驗數據利用SPSS 20.0軟件進行統計檢驗，采用t檢驗分析去脂前后各軟組織碳氮穩定同位素差異，用單因素方差分析(One-way ANOVA)對軟組織間碳氮穩定同位素進行差異性分析和Post-hoc檢驗，利用Origin 9.1軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 脂類對碳氮穩定同位素的影響

配對t檢驗顯示，肌肉、性腺、消化腺3種軟組織中，除消化腺中δ15N去脂前后無顯著性差異(P>0.05)外，其余軟組織去脂前后δ13C、δ15N和C/N均存在顯著性差異(P<0.05)(表2，圖2)。

肌肉中，δ13Cafter與δ13Cbefore相比升高0.70‰～1.82‰，平均升高1.13‰；δ15Nafter與δ15Nbefore相比升高0.48‰～1.59‰，平均升高1.02‰；C/Nafter與C/Nbefore相比降低0.11～0.31，平均降低0.21。線性回歸分析表明，δ13Cbefore與δ13Cafter、δ15Nbefore與δ15Nafter、C/Nafter與C/Nbefore間均存在顯著正相關 (P<0.05) (圖3)。

性腺中，δ13Cafter與δ13Cbefore相比升高0.70‰～2.44‰，平均升高1.38‰；δ15Nafter與δ15Nbefore相比升高-0.18‰～2.34‰，平均升高0.41‰；C/Nafter與C/Nbefore相比降低0.21～0.86，平均降低0.43。線性回歸分析表明：δ13Cbefore與 δ13Cafter、C/Nafter與C/Nbefore均無顯著相關性(P>0.05)，而δ15Nbefore與δ15Nafter存在顯著正相關(P<0.05)(圖3)。

消化腺中，δ13Cafter與δ13Cbefore相比升高0.84‰～2.23‰，平均升高1.27‰；δ15Nafter與δ15Nbefore相比升高-0.75‰～0.99‰，平均升高0.39‰；C/Nafter與C/Nbefore相比降低0.20～0.82，平均降低0.37。線性回歸分析表明：δ13Cbefore與δ13Cafter、δ15Nbefore與δ15Nafter均存在顯著正相關 (P<0.05) ，而C/Nafter與C/Nbefore無顯著相關性(P>0.05)(圖3)。

表2 脂類去除前后穩定同位素值Tab.2 Stable isotope values before and after lipid removal

2.2 穩定同位素組織間差異

3種不同的軟組織間δ13C、δ15N、C/N在脂類去除前或去脂后均具有顯著性差異(P<0.05)。不同組織去脂前或去脂后δ13Cbefore依次均為肌肉>消化腺>性腺；去脂前或去脂后δ15Nbefore依次均為肌肉>消化腺>性腺；去脂前C/Nbefore依次為性腺>消化腺>肌肉，去脂后C/Nafter依次為消化腺>性腺>肌肉。去脂后3種組織間碳氮穩定同位素有明顯的差異，3種組織的δ13C值范圍相較于δ15N變化范圍較窄(圖4)。Post-hoc檢驗結果顯示，δ13C、δ15N去脂前或去脂后兩兩組織間均有顯著性差異(P<0.05)；C/N值除去脂前肌肉與性腺間、去脂后性腺與消化腺間無顯著性差異(P>0.05)外，其余兩

圖3 3種組織脂類去除前后穩定同位素相關性分析Fig.3 Correlation analysis of stable isotopes in three tissues before and after the lipid removal

圖4 脂類去除后不同組織δ13C、δ15N營養生態位圖Fig.4 Trophic ecology of δ13C and δ15N in different tissues after lipid removal

組織間均有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 脂類去除對碳穩定同位素的影響

由于脂類中的δ13C含量比蛋白質和碳水化合物中的含量小，所以脂類含量較高的組織中δ13C含量更低，因此，脂類去除之后會導致δ13C值上升[14-15]。本研究中，去脂后的莖柔魚肌肉、性腺、消化腺中δ13C均明顯增加，去脂后δ13C在肌肉組織、性腺、消化腺等3種組織中平均分別提升了1.13‰、1.37‰、1.27‰，由此也可推測，莖柔魚性腺中脂類含量較高，消化腺次之，肌肉中最小。Ruiz-Cooley等[10]對圓鰭槍烏賊Lollingunculabrevis和普氏槍烏賊Loligopleii研究發現，去脂后δ13C分別升高了1.6‰和2.7‰，并指出δ13C變化范圍與物種、個體大小及組織中的脂類含量有關。本研究中δ13C的變化也體現了組織間穩定同位素的差異，與上述文獻結果一致。脂類的存在導致δ13C測定值產生偏差，從而影響了對消費者食物來源的分析，因此，利用穩定同位素技術對頭足類軟組織進行食性分析時應先進行脂類去除。

3.2 脂類去除對氮穩定同位素的影響

Bodin等[15]、Yurkowski 等[16]研究表明，使用未去脂樣品的δ15N值計算莖柔魚的營養級將會偏低，這是因為脂蛋白化合物具有較低的 δ15N，其被抽提后會引起樣品中δ15N 升高,因而要盡量使用去脂后的δ15N進行分析。本研究中發現，脂類去除后莖柔魚肌肉、性腺中的δ15N 顯著升高，而消化腺中δ15N 也有上升但并不顯著，δ15N在肌肉、性腺、消化腺等3種組織中平均分別提升了1.02‰、0.41‰、0.39‰，再次證明了不去脂會影響莖柔魚營養生態位的計算。不同組織器官的營養成分和結構不同，從而導致δ15N 值在不同組織器官間存在差異[17-19]，本研究中肌肉、性腺、消化腺δ15N值具有顯著性差異也符合這一結論。Post等[20]在研究穩定同位素技術是否需要考慮脂類影響時發現，C/N<3.5 時不需要進行脂類的去除。而后又有研究發現，雖然C/N 值較小(C/N<3.5)，但脂類去除后莖柔魚δ13C升高范圍較大(>0.65‰)，脂類含量存在較大差異的組織仍然可能有相近的C/N 值，所以C/N 值可能不適合作為衡量莖柔魚脂類含量的標準[11]。本研究中，肌肉、性腺、消化腺中C/N均小于3.5，但是脂類去除后3種組織中δ13C、δ15N均有顯著升高，這與貢藝等[21]對北太平洋柔魚肌肉分析結果一致，故在C/N均小于3.5的條件下仍需進行去脂處理。

3.3 不同組織間穩定同位素差異

研究表明，生物體不同組織間周轉率存在差異[22]，頭足類肌肉中穩定同位素轉化率較慢，一般為幾周或者更長，因此，肌肉的穩定同位素比值僅能反映出機體幾周或數月前的攝食情況，而消化腺和性腺中的穩定同位素轉化率較快，可表征機體幾天內的攝食情況[23-24]，這也是本研究不同組織間穩定同位素差異的原因之一。因此，可以根據不同組織的δ13C、δ15N周轉率的差異，從不同時間尺度來分析頭足類的攝食變化。

本研究中對莖柔魚不同組織器官中穩定同位素的分析，揭示了δ13C、δ15N 值在不同組織器官的分布特征及脂類去除對穩定同位素分析的影響，為穩定同位素技術在頭足類生態學中的研究供了重要基礎。盡管如此，本研究中也存在不足之處，例如性腺樣本較少且大部分樣品性成熟度較低，樣品覆蓋范圍較小，不同體質量大小的樣本個數分布不均，個體大小不同對其穩定同位素的影響仍需后期繼續研究。在今后的研究中需要進一步補充樣品量，進而分析軟組織中穩定同位素值在性別上的差異等。

4 結論

1) 脂類去除前后δ13C、δ15N、C/N在肌肉、消化腺和性腺等3種軟組織間均具有顯著性差異，消化腺中δ15N除外。

2) 不同組織穩定同位素含量比較顯示，脂類去除前或去脂后，δ13C與δ15N值均依次為肌肉>消化腺>性腺；C/Nbefore依次為性腺>消化腺>肌肉，C/Nafter依次為消化腺>性腺>肌肉。