溫度對駝背鱸幼魚生長、耗氧和熱耐受性的影響

張善發(fā)，董宏標，王茜，張家松*

(1.北京大學深圳研究生院 環(huán)境與能源學院，廣東 深圳 518055； 2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300)

魚類是變溫動物,溫度是影響魚類生存最重要的環(huán)境因子之一，直接影響其存活、生長、呼吸和代謝在內(nèi)的生理和生化指標[1]，魚類對環(huán)境溫度具有一定的耐受范圍，生命活動嚴格受其棲息水環(huán)境的限制[2]，水溫過高或過低均會影響魚類的生長性能，適宜的水溫有利于魚類快速生長，降低病害侵襲，提高存活率[3]，若水溫超過了魚類的耐受范圍，魚類將較難生存[4]。

目前，有關(guān)溫度對魚類生長性能的研究報道較多，如在水溫為14～26 ℃時，云南盤鮈Discgobioyunnanensis仔稚魚生長速度隨著溫度升高而加快，但其存活率并無顯著性差異[5]；亞東鮭Salmotrutta幼魚的存活率和生長率在15 ℃時達到最佳值[3]；河川沙塘鱧Odontobutisobseura幼魚和紅鰭東方鲀Takifugurubripes幼魚的耗氧率隨水溫的升高而增大，且均具有良好的直線回歸關(guān)系[6-7]；在水溫為20～32 ℃時,梭鱸Sanderlucioperca幼魚的耗氧率、排氨率和窒息點均隨著溫度的升高而上升[4]；花鱸lateolabraxmaculatus幼魚在15、20、25 ℃ 3個馴化溫度下，其最大臨界溫度和最小臨界溫度都與馴化溫度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系[8]；尖頭鱥Rhynchocyprisoxycephalus的熱耐受性受到溫度馴化的影響,表現(xiàn)為高溫馴化可升高最大臨界溫度，低溫馴化可降低最小臨界溫度[2]。

駝背鱸Cromileptesaltivelis,俗稱老鼠斑、鳘魚、銳首擬石斑,隸屬于鮨科Serranidae石斑魚亞科Epinephelinae駝背鱸屬Cromileptes，主要分布于熱帶、亞熱帶暖水海域，中國見于南海[1]。駝背鱸在中國資源量極少，其生長緩慢，食用和觀賞價值兼?zhèn)洌瑑r格昂貴，為名貴海產(chǎn)經(jīng)濟魚類，養(yǎng)殖前景廣闊。目前，有關(guān)駝背鱸的研究主要集中在生物學特性、人工繁育、工廠化養(yǎng)殖、營養(yǎng)需求、生理疾病等方面[9-19]，而有關(guān)溫度對駝背鱸影響的研究報道較少，報道多關(guān)注不同溫度下生長、耗氧率及熱耐受性等一個或兩個標指的變化，且已報道的養(yǎng)殖溫度范圍有限，難以避免溫度刺激(如持續(xù)高溫≥30 ℃)造成的損失，并未全面考慮溫度對其生長、耗氧率及熱耐受性的影響[15-16]。為此，本研究中系統(tǒng)地進行了低溫、常溫和高溫對駝背鱸幼魚生長、耗氧率及熱耐受性的影響試驗，旨在為駝背鱸的溫度響應機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為駝背鱸養(yǎng)殖與管理提供更完善的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

駝背鱸幼魚購自中山衍生水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體質(zhì)量為(21.38±1.27) g，運輸至室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖池(圓形池，直徑為4.5 m，水深為0.9 m)暫養(yǎng)穩(wěn)定2周，暫養(yǎng)密度為30尾/m3。暫養(yǎng)期間，投喂“日清”牌石斑魚配合飼料，每日9:00投喂一次，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%～4%，并根據(jù)攝食和生長情況做適當調(diào)整，飽食投喂。養(yǎng)殖水日循環(huán)率為400%，水溫為(28±0.5)℃，鹽度為30，溶解氧質(zhì)量濃度大于6 mg/L，pH為(8.0±0.2)，氨氮質(zhì)量濃度小于 0.2 mg/L，自然光周期。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 養(yǎng)殖試驗設(shè)置低溫組(24 ℃±1 ℃)、常溫組(28 ℃±1 ℃)和高溫組(32 ℃±1 ℃)，每組設(shè)3個平行，試驗在9個1 m3獨立玻璃纖維圓桶中進行，每桶隨機放置經(jīng)暫養(yǎng)后規(guī)格相近的健康駝背鱸幼魚30尾。高溫組以500 W加熱棒輔以溫控儀控溫(32 ℃±1 ℃)，常溫組為養(yǎng)殖期間正常水溫組(28 ℃±1 ℃)，低溫組以冷水機控溫(24 ℃±1 ℃)，早晚各換水50%，每組所換新水經(jīng)調(diào)溫后使用。養(yǎng)殖期間日常管理和水環(huán)境指標與暫養(yǎng)階段相同，養(yǎng)殖試驗共進行56 d。

1.2.2 生長指標的測定與計算 養(yǎng)殖試驗前記錄每組魚平均體質(zhì)量(m0)，試驗結(jié)束后記錄每組魚終末平均體質(zhì)量(mt)及存活數(shù)量(Nt)，并按下式計算各試驗組魚的體質(zhì)量增長率(%)、體質(zhì)量特定生長率(%/d)和存活率(%)：

體質(zhì)量增長率=(mt-m0)/m0×100%，

體質(zhì)量特定生長率=(lnmt-lnm0)/t×100%，

存活率=(Nt/N0)×100%。

其中：mt、m0分別為試驗終末和初始各組魚平均體質(zhì)量(g)；Nt、N0分別為試驗終末和初始各組魚存活數(shù)量(ind.)；t為養(yǎng)殖時間(d)。

1.2.3 耗氧率與窒息點的測定與計算 養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，選取低溫組、常溫組和高溫組駝背鱸各40尾，饑餓一天后，用于耗氧率和窒息點的測量，試驗期間試驗水體維持其養(yǎng)殖試驗時溫度。

1)耗氧率測定試驗。采用靜水呼吸室法，在10 L呼吸瓶中進行，瓶子置于控溫水槽中，試驗時，先將每個呼吸瓶灌滿海水，然后慢慢放入幼魚，蓋上蓋后用液體石蠟密封，防止漏水或空氣進入，整個試驗歷時2 h。試驗開始前和結(jié)束后均用碘量瓶取水樣，固定，測定其溶氧量。試驗結(jié)束后，用濾紙吸干試驗幼魚體表水分稱重，并用盛海水的量筒測定試驗幼魚的體積。每個試驗溫度組設(shè)置6個重復，每個重復1尾魚，并設(shè)置空白組。試驗開始前，稱量測試魚的體質(zhì)量。采用碘量分光光度法測定試驗組和空白組始末溶氧量。

2)窒息點測定試驗。在10 L呼吸瓶中進行，試驗時，先將每個呼吸瓶灌滿海水，然后慢慢放入幼魚，蓋上蓋后用液體石蠟密封，防止漏水或空氣進入。每個溫度組設(shè)置4個重復，每個重復8尾魚，隨時觀察測試魚情況，當瓶中有一半的魚出現(xiàn)側(cè)翻、失去平衡、呼吸頻率降低時，取樣測定呼吸室中水體的溶氧量，即為其窒息點[20]。采用碘量分光光度法測定溶氧量。

耗氧率計算公式為

RO=(Oct-Ot)×V/(m×t)。

其中：RO為單位體質(zhì)量耗氧率[mg/(g·h)]；Ot為試驗結(jié)束時呼吸瓶中的溶解氧質(zhì)量濃度(mg/L)；Oct為試驗結(jié)束時空白瓶中的溶解氧質(zhì)量濃度(mg/L)；V為呼吸瓶去除試驗魚后的體積(L)；m為瓶中幼魚的體質(zhì)量(g)；t為試驗持續(xù)時間(h)。

3)溫度系數(shù)(temperature coefficient，Q10)。其計算公式為

Q10=(RO2/RO1)10/(θ2-θ1)。

其中：RO1和RO2分別為θ1和θ2溫度下的耗氧率[mg/(g·h)]；θ1和θ2為養(yǎng)殖溫度(℃)。

1.2.4 不同溫度下臨界溫度(θC)值的測定θC值測定參照González等[21]的方法，并略做修改。選取低溫組、常溫組(對照組)和高溫組規(guī)格相近駝背鱸各12尾，試驗前停喂一天，用于臨界耐受高溫(θC,h)和臨界耐受低溫(θC,l)的檢測。每個養(yǎng)殖溫度組設(shè)3個重復，每次檢測4尾魚，在10 L玻璃缸中進行，通過加熱棒和冷水機水浴調(diào)溫，試驗水體起始溫度同養(yǎng)殖溫度，微充氣，待試驗魚穩(wěn)定適應1 h后開始升/降溫，升/降溫速率為(5.0±0.2)℃/h。全程觀察試驗魚活動情況，當魚出現(xiàn)身體側(cè)翻、玻棒觸碰無反應時，立即取出對應留點溫度計(精確度0.1)，待讀，并及時撈出魚放至與養(yǎng)殖溫度相同的水中，若能恢復則該數(shù)據(jù)有效。

1.2.5 魚體肝臟和鰓組織HSP70蛋白表達量的測定 從每個溫度養(yǎng)殖組取6尾魚(每個平行2尾)，活體解剖取其肝臟和鰓組織，用液氮保存，采用魚類HSP70 ELISA分析試劑盒(上海酶聯(lián))檢測HSP70蛋白的表達量，檢測方法按說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標準誤表示(mean±S.E.)，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異顯著，采用LSD法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 各溫度組駝背鱸幼魚的生長與存活情況

從表1可見：駝背鱸在水溫為24～32 ℃時均能正常生長，駝背鱸幼魚在28 ℃環(huán)境條件下生長最好，其體質(zhì)量增長率和特定生長率分別為55.81%和1.475%/d，均顯著高于24 ℃和32 ℃組(P<0.05)；28 ℃和24 ℃時駝背鱸幼魚都保持了較高的存活率，分別為88.33%和86.67%，且二者無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于32 ℃組(P<0.05)。

表1 不同溫度下駝背鱸幼魚生長和存活率Tab.1 Growth and survival rate of juvenile humpback grouper Cromileptes altivelis under different temperatures

2.2 各溫度組駝背鱸幼魚的耗氧率和窒息點

在窒息點試驗過程中，駝背鱸幼魚開始表現(xiàn)非常平靜，隨著時間的推移和溶解氧質(zhì)量濃度的下降，幼魚開始出現(xiàn)躁動、到處游動、活動能力減弱、平衡力喪失、頭部上揚、嘴部鰓蓋逐步打開等瀕臨死亡現(xiàn)象，不同溫度下駝背鱸幼魚的死亡過程是一致的，但溫度越高其不適行為出現(xiàn)的時間越早，這與溫度和耗氧率升高導致幼魚窒息的研究結(jié)果相吻合。

從表2可見，駝背鱸的耗氧率、窒息點值均隨溫度的升高而增加，且各溫度組間的耗氧率和窒息點均有顯著性差異(P<0.05)。耗氧率(R)、窒息點(S)與水溫(θ)之間的擬合方程分別為

R=0.010θ-0.034(R2=0.855,P<0.001),

S=0.079θ-0.366(R2=0.923,P<0.001)。

這表明，在正常生長水溫下(24～32 ℃)，駝背鱸幼魚耗氧率和窒息點均隨水溫的升高而升高，且溫度越高其耗氧速率越大。

Q10指標通常用于評價生物對溫度變化的敏感性。從表2可知，24～32 ℃的Q10值為1.500，其中，28～32 ℃的Q10值最大，為1.538，24～28 ℃最小，為1.462。這表明，駝背鱸幼魚對高溫區(qū)間(28～32 ℃)溫度變化的敏感性高于低溫區(qū)間(24～28 ℃)，此外，隨著溫度升高，駝背鱸幼魚進入適宜生長階段，呼吸活動受溫度影響增強，Q10值逐漸變大。

表2 不同溫度下駝背鱸幼魚耗氧率、窒息點和Q10值

2.3 各溫度組駝背鱸幼魚的熱耐受性能

臨界耐受溫度(θC,h、θC,l)是評價生物對溫度耐受性能的常用指標之一。從表3可見：駝背鱸幼魚在24、28、32 ℃下的臨界耐受高溫值分別為(37.12±0.68)、(39.2±0.4)、(41.05±0.7)℃，其與水溫(θ)的擬合方程為θC,h=0.491θ+25.38(R2=0.929)，臨界耐受低溫值分別為(12.70±0.28)、(14.92±0.55)、(17.76±0.42)℃，其與水溫(θ)的擬合方程為(θC,l=0.632θ-2.584(R2=0.979)；24～32 ℃下的臨界高低溫差值分別為24.42、24.35和23.29。這表明，在本試驗溫度下，駝背鱸幼魚的臨界溫度隨養(yǎng)殖溫度的升高而升高，臨界高低溫差值相對穩(wěn)定，受養(yǎng)殖溫度影響較小。在24～32 ℃時，隨著養(yǎng)殖溫度的升高，養(yǎng)殖溫度與臨界高溫差值逐漸縮小，而與臨界低溫差值逐漸增加，這說明駝背鱸幼魚養(yǎng)殖溫度越高，高溫致死溫度范圍越窄。

表3 不同溫度下駝背鱸幼魚的臨界溫度Tab.3 Critical temperature of juvenile humpback grouper Cromileptes altivelis under different temperatures ℃

2.4 各溫度組駝背鱸幼魚肝臟和鰓組織HSP70蛋白的表達量

從圖1可見：32 ℃組駝背鱸幼魚肝臟和鰓組織的HSP70蛋白表達量顯著高于24、28 ℃組(P<0.05)，而24、28 ℃組間無顯著性差異(P>0.05);駝背鱸幼魚高溫組HSP70蛋白表達量一直維持較高水平，說明32 ℃高溫對其有持續(xù)性的熱應激，因此,也影響了其耗氧率和生長速度。

標有不同字母者表示同一組織不同溫度組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。Means with different letters in different temperature in the same tissue are significantly different at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖1 不同溫度下駝背鱸幼魚肝臟和鰓組織HSP70蛋白表達量Fig.1 Expression level of HSP70 protein in liver and gill of juvenile humpback grouper Cromileptes altivelis under different temperatures

3 討論

3.1 溫度對駝背鱸幼魚生長與存活的影響

魚類是變溫動物，溫度是影響其新陳代謝的重要因子之一，溫度升高能夠加強生物體內(nèi)的代謝，但超過一定范圍會抑制其生長，甚至造成生物體死亡[22]。楊明秋等[15]根據(jù)季節(jié)性水溫變化推測駝背鱸的適宜生長溫度為 25～33 ℃，在此溫度范圍之外駝背鱸生長緩慢或受到抑制。本研究中發(fā)現(xiàn)，駝背鱸在水溫為24～32 ℃時均能較好生長，這與楊明秋等[15]研究結(jié)果基本一致，在本試驗條件下，駝背鱸幼魚28 ℃組生長最好，其體質(zhì)量增長率、特定生長率均顯著高于24、32 ℃組，28 ℃組存活率明顯高于32 ℃組，但與24 ℃組間無顯著性差異，因此，在人工養(yǎng)殖中應盡量避免低溫對生長帶來的不利影響，僅從存活率角度來說，選擇稍高溫度進行駝背鱸幼魚培育工作，可以保證較高的存活率。

3.2 溫度對駝背鱸幼魚耗氧率和窒息點的影響

耗氧率是動物有氧代謝強度的重要指標之一，直接反映水溫對水生動物新陳代謝的影響。隨著水溫升高，機體維持生命的心、肝等重要組織器官的活性增強，各種酶活性提高，活動強度增大，基礎(chǔ)代謝旺盛，耗氧率升高。大量研究表明[10]，在適溫范圍內(nèi)，魚類呼吸作用一般隨著水溫的升高而升高。

水生動物的窒息臨界含氧量，也稱為窒息點或氧閾，是水生動物所能忍受低氧的下限指標，直接反映了不同溫度下水生動物對于水體溶解氧的需求。陳婉情等[16]分別在20、25、30 ℃下研究了駝背鱸幼魚耗氧率和窒息點狀況，結(jié)果表明，駝背鱸幼魚耗氧率在3種水溫下雖有不同，但無顯著性差異，對駝背鱸幼魚窒息點的研究表明，20 ℃與25、30 ℃間有明顯差異，但25 ℃與30 ℃間并無明顯差異，陳婉情等[16]認為,駝背鱸的耗氧率和窒息點對水溫的變化不敏感。本試驗中發(fā)現(xiàn)，在正常生長水溫下(24～32 ℃)，駝背鱸幼魚耗氧率和窒息點均隨水溫的升高而升高且差異明顯(P<0.05)，此結(jié)果和陳婉情研究結(jié)果不一致，有待于進一步研究。

溫度系數(shù)(Q10)用來表示生物體對溫度的敏感程度，是反映生物體內(nèi)反應速率與溫度依存關(guān)系的一個指標，Q10值越大,表示溫度對生物生理活動的影響越大。目前，利用Q10反映溫度對魚類代謝速率的影響已被學界接受[23]。本研究表明，試驗魚對高溫區(qū)間(28～32 ℃)溫度變化的敏感性高于低溫區(qū)間(24～28 ℃)。

3.3 溫度對駝背鱸幼魚臨界耐受溫度的影響

熱耐受水平反映了動物在特定熱環(huán)境中的生存能力，幼魚和成魚需要完成覓食、求偶、拓展生境等多種復雜生態(tài)過程，棲息地環(huán)境變動可能較大，保持較高的熱忍耐水平對于動物在極端溫度下完成攝食、避敵等生命活動較為有利[24]。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖溫度下駝背鱸幼魚的臨界耐受溫度隨養(yǎng)殖溫度的升高而升高，24～32 ℃下的臨界高溫(θC，h)和臨界低溫(θC，l)分別為37.12～41.05 ℃和12.70～17.76 ℃，試驗數(shù)據(jù)表明，正常生長水溫下的駝背鱸對升溫的敏感性弱于降溫。此結(jié)果對于養(yǎng)殖過程中極端水溫變化具有一定的借鑒意義。

3.4 不同溫度下駝背鱸幼魚HSP70蛋白表達與生長的相關(guān)性

生物體通過HSP的誘導表達獲得抵御應激的能力，表達量越高其抵御能力越強，但從另一方面看，表達量高也可反映其所受的應激程度較大。保持較高的熱忍耐水平往往以減少動物在適宜溫度范圍內(nèi)的生存適合度為代價[25]。由于維持高的熱忍耐水平，通常需要機體上調(diào)熱激蛋白表達，改變細胞膜磷脂組成及酶活性等一系列生理生化耗能過程，因此，動物熱耐受性的維持可能面臨基于能量代價與生態(tài)收益的權(quán)衡[26]。本研究中，對駝背鱸幼魚肝臟和鰓組織HSP70蛋白表達量的測定結(jié)果表明，高溫組(32 ℃)幼魚肝臟和鰓組織的HSP70蛋白表達量一直維持較高水平，說明存在持續(xù)性的熱應激，因此，也影響了其耗氧率和生長速度。