中華草龜腐皮裂甲病病原的分離鑒定和組織病理學研究

劉宇婷，徐金鋮，潘連德，2，3*

(1.上海海洋大學 省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室,上海 201306； 2.水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 201306；3.農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

近年來，隨著大規模、集約化的養殖，龜類各類疾病的突發日益增多[1]。同時，學界也進行了相關研究，上海海洋大學水族寵物醫學實驗室對龜類疾病進行了大量研究，在病原學方面，報道了綠海龜Cheloniamydas背甲壞死病的病原真菌[2]、巴西龜Trachemysscriptaelegans等寵物龜眼炎的病原菌[3];在病理學方面，報道了巴西龜肺炎眼炎綜合征的病理學[4]，分析了寵物龜的灰白甲疾病[5]及菱斑龜Malaclemysterrapm肝病的組織病理變化[6]；在臨床藥理學方面，報道了恩諾沙星[7]及吡喹酮[8]在中華草龜體內的藥物代謝動力學及毒理學的研究。

中華草龜Chinemysreevesiis隸屬于爬行綱Reptile龜鱉目Testudines龜科Emydidae，擁有較高的食用、觀賞和藥用價值，已成為中國重要的養殖品種[9]。嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila屬革蘭氏陰性菌，為氣單胞菌屬Aeromonas中的一種[10]，是引起淡水養殖動物病害的主要病原細菌[11]。目前，已知嗜水氣單胞菌是中華鱉Trionyxsinensis體表疾病穿孔病、腐皮病、疥瘡病、水泡病、爛頸病、紅底板的主要病原菌[12-18]，同時也是引起淡水養殖魚類細菌性敗血癥的主要病原菌[19]。

江西省南昌市某養龜場近幾年出現嚴重疫情，此次病例中，中華草龜腹甲干裂發黑癥狀嚴重，是發現的首例腹甲類新型疾病，致死率高達40%，患病龜不愿露出水面，食量大減，不愛爬動。在養殖場中種龜池受精率從95%降至70%，孵化率從80%～90%降至20%～30%，產卵場出現較多軟殼蛋，軟殼率達到20%。本研究中，針對該養殖場龜出現的病癥，對中華草龜腐皮裂甲病的病原菌進行分離鑒定，并對其組織病理變化進行觀察，旨在為臨床防治提供技術依據，也為研究中華草龜體表疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

11只患病中華草龜種龜(編號為1～11號)取自江西南昌某養龜場種龜池；健康中華草龜購自湖南呈寶龜類繁養有限公司(平均體質量為0.433 kg/只)，于上海海洋大學水族寵物醫學實驗室馴養兩周后進行人工回感試驗，馴養期間不喂食，水溫控制在28 ℃。

主要試劑：沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)(北京三藥科技開發公司);血瓊脂培養基、細菌生化微量鑒定管、藥敏紙片(均為杭州微生物試劑有限公司)；革蘭氏染液(河南美凱生物科技有限公司);DNA 抽提試劑盒、DreamTaq-TM DNA Polymerase、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒、DNA Ladder Mix Maker、PCR擴增引物(均為生工生物工程(上海)股份有限公司)。

主要儀器：DYY-5穩壓電泳儀(北京六一儀器廠); 2720 thermal cycler PCR 儀(Applied Biosystems);FR980凝膠成像儀(上海復日科技儀器有限公司);HC-2518R冷凍高速離心機(Bio Basic Inc生工生物工程股份有限公司); X光造影儀(上海查理寵物醫院)。

1.2 方法

1.2.1 病龜病理解剖觀察 用醫用酒精棉對患病草龜體表消毒，將瀕臨死亡和剛死亡的患病草龜在無菌條件下進行解剖和臨床診斷，留取代表性樣品的臟器組織切塊、固定，用于組織病理制片。

1.2.2 病原菌分離純化及形態觀察 解剖病龜后，將接種環在酒精燈上灼燒，冷卻后用其刮取病龜的腹甲、肝臟、肺、腎臟組織并迅速劃線接種于瓊脂培養基上，標記編號后置于28 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h，多次分離純化優勢菌，并觀察優勢菌在培養基上菌落的顏色、大小、形態等。

1.2.3 血瓊脂培養基鑒定菌的溶血性 在無菌條件下，用接種環蘸取分離純化好的優勢菌株劃線接種到血瓊脂培養基上，標記編號后置于恒溫培養箱(28 ℃)中培養18～24 h，觀察菌株的溶血性。

1.2.4 革蘭氏染色鏡檢 在無菌條件下進行革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡下觀察菌株的形態和染色特征，判定其結果。

1.2.5 生理生化試驗 將菌懸液用移液槍轉移到生化鑒定管中，培養24～48 h后觀察結果。

1.2.6 16S rDNA序列及其系統發育分析 按照基因組DNA抽取試劑盒提取純化菌株的DNA，將其作為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(20 μL)：10×PCR Buffer 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，Dntp 0.5 μL，用雙蒸水補足至20 μL。PCR反應條件：96 ℃下預變性1 min；96 ℃下變性10 s，50 ℃下退火復性5 s，60 ℃下延伸4 min，共進行30個循環。將目的片段切膠回收純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序并構建系統發育樹。引物序列為27F:AGAGTTTGATCMGGCTCAG，1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT。

1.2.7 疑似病原菌的人工回感試驗 將分離得到的PF-11菌株擴增培養后，對健康的54 只中華草龜進行腹腔注射(菌懸液濃度為1×108CFU/mL)、菌懸液浸泡(菌懸液濃度為1×105CFU/mL)和斜面懸掛3種方式感染，每一種感染方式設試驗組、平行組、對照組，每組6只中華草龜。①腹腔注射：將分離純化的菌株配制成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，以0.2 mL/只的劑量腹腔注射試驗組草龜(編號b1、b2、b3、b4、b5、b6)和平行組草龜(編號bⅠ、bⅡ、bⅢ、bⅣ、bⅤ、bⅥ)，對照組草龜(編號B1、B2、B3、B4、B5、B6)注射無菌生理鹽水0.2 mL/只； ② 菌液浸泡：用分離純化的菌株配制濃度為1×105CFU/mL的水體，將試驗組草龜(編號a1、a2、a3、a4、a5、a6)和平行組草龜(aⅠ、aⅡ、aⅢ、aⅣ、aⅤ、aⅥ)放入其中浸泡，對照組(編號A1、A2、A3、A4、A5、A6)； ③ 斜面懸掛：將嗜水氣單胞菌(PF-11菌株)接種到1.5 mL離心管中，采用斜面培養,待菌株生長24 h后，沿斜面剪出橢圓形橫截面，使之與試驗組草龜(編號d1、d2、d3、d4、d5、d6)和平行組草龜(編號dⅠ、dⅡ、dⅢ、dⅣ、dⅤ、dⅥ)甲橋上的盾片吻合，固定方法參照綠海龜背甲壞死病菌株的固定方法[2],對照組(編號D1、D2、D3、D4、D5、D6)。

將試驗組、平行組、對照組的中華草龜分開飼養，每天觀察記錄其狀態，以及發病和死亡情況。

1.2.8 病原菌藥敏試驗 采用K-B藥敏紙片法，每個平板放3個藥敏片，標記編號后置于28 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h, 用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每組試驗設3個重復，最后取其平均值作為最終結果。

1.2.9 組織病理檢驗 用施立特迷你電鉆在龜腹甲干裂變色處取樣，置于EDTA液中脫鈣20 d。解剖取病龜心、肝、脾、肺、腎等組織切成約5 mm組織塊，置于體積分數為10%的中性福爾馬林中固定24 h后，沖水5 h。用體積分數為50%～100%的乙醇溶液對試驗龜甲和組織塊逐級脫水、透明。于56～58 ℃下用石蠟包埋，切片厚度為5～7 μm，于60 ℃下烘片1 h，H.E染色，中性樹膠封片，在顯微鏡(徠卡DM3000)下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 病龜的臨床癥狀和病理解剖觀察

記錄11只患病中華草龜雌雄、背甲長、背甲寬、背甲厚、體質量、臨床癥狀及病理解剖結果(表1)。臨床癥狀上,腹甲分為3種情況:4號、9號龜(圖1A、B)腹甲外觀正常；1號(圖1E、F)、3號、7號龜腹甲局部干裂發黑；2、5、6、8、10、11號龜(圖1I、J)腹甲大部分干裂、發黑。病理解剖上，11只龜均表現出肝臟發黑、肺發白、腸道無內容物、有腹水、內臟團伴有惡臭味。病龜精神狀態均表現呆滯，不愛爬動。從腹甲的3種情況中各選一例病龜(9、1、11號)做對比，結果如圖1所示。

2.2 病原菌的分離純化及形態觀察

從患病中華草龜的腹甲、肝臟、肺3處組織中共提取33 株菌株，將分離純化的菌株在培養基上顯示，均具有顏色呈白色、形狀標點狀、表面光滑隆起、邊緣整齊、顯濕潤、易被接種環挑起的菌落特征(圖2A)。

2.3 血瓊脂培養基鑒定及革蘭氏染色鏡檢

血瓊脂培養基鑒定結果表明，有5 株菌株呈陽性，其他菌株呈陰性，其中5 株陽性菌分別為取自1號病龜肝臟組織編號GZ-1的菌株，5號病龜肝臟組織編號GZ-5的菌株，5號病龜肺組織編號F-5的菌株，10號病龜肺組織編號F-10的菌株，11號病龜腹甲組織編號PF-11的菌株。圖2B為PF-11菌株陽性結果和F-6菌株陰性結果。

革蘭氏染色結果表明，血瓊脂培養基呈陽性的5 株菌均為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，圖2C為PF-11菌株革蘭氏染色結果。

2.4 生理生化試驗結果

生理生化試驗結果表明：血瓊脂培養基呈陽性的5株菌對葡萄糖產酸、葡萄糖產氣、蔗糖、甘露糖、肌醇、蛋白胨水、阿拉伯糖、V-P試驗、精氨雙水解酶反應呈陽性，而對賴氨酸脫羧酶反應呈陰性，在0%和3%的NaCl胨水中(渾濁)生長，在8%和10%的NaCl胨水中未變渾濁(表2)。參照《常見細菌系統鑒定手冊》，這5 株菌與弧菌科的嗜水氣單胞菌基本相似，初步鑒定為嗜水氣單胞菌。

2.5 16S rDNA序列及其系統發育分析

血瓊脂培養基呈陽性的5株菌株經PCR擴增得到長度約1 500 bp的16S rRNA片段，圖2D為PCR電泳結果。將得到的產物回收獲得株菌的16S rDNA部分基因序列。在NCBI網站，將已知序列在GenBank數據庫中進行相似性搜索，該菌已提交至GenBank(登陸號為MK007301.1)，結果表明，GZ-1、GZ-5、F-5、F-10、PF-11與嗜水氣單胞菌的一致性高達100%。通過最大簡約法將PF-11菌株構建系統發育樹(圖3)，結果表明，本次試驗提取的菌株與嗜水氣單胞菌的親緣關系最近。

A—9號龜背甲；B—9號龜腹甲, 腹甲正常；C—9號龜內臟解剖；D—9號龜內臟團，肝臟發黑()，肺部發白(←)；E—1號龜背甲；F—1號龜腹甲，腹甲局部發黑干裂()；G—1號龜內臟解剖；H—1號龜內臟團, 肝臟發黑(), 肺部發白(←)；I—11號龜背甲；J—11號龜腹甲, 腹甲大部分干裂發黑()；K—11號龜內臟解剖；L—11號龜內臟團，肝臟發黑()，肺發白(←)。A—carapace of Chinese tortoise No.9; B—plastron of Chinese tortoise No.9，and the plastron is intact; C—the visceral anatomy diagram of No.9; D—the visceral diagram of No.9， and the liver is black () and the lungs are white (←); E—the carapace of No.1; F —plastron of No.1, and the plastron is partially black and chapped (); G—the anatomical diagram of viscera of No.1; H—the visceral mass diagram of No.1, the liver is black (), and the lungs are white (←) ; I—carapace in No.11; J—plastron in No.11, most of the plastron is dry crack and black (); K—the visceral anatomy diagram of No.11; L—the visceral mass diagram of No.11，the liver is black ()， and the lungs are white (←).圖1 9、1、11號患病中華草龜的臨床癥狀和解剖結果Fig.1 Clinical anatomy of sick Chinses pond turtle Chinemys reevesiis No.9, 1, and 11

A—PF-11菌株分離純化的結果；B—左邊為F-6菌株血瓊脂培養基的陰性結果，右邊為PF-11菌株的血瓊脂培養基的陽性結果；C—PF-11菌株的革蘭氏染色陰性結果；D—PF-11菌株的PCR電泳產物結果，M—3 000 Ladder Maker。A—isolation and purification of PF-11 strain; B—the negative result of blood agar culture dish of F-6 strain on the left, and the positive result of blood agar culture dish of PF-11 strain on the right; C—the gram negative staining results of PF-11 strain; D—the result of PCR electrophoresis products of PF-11 strain, M—3 000 Ladder Maker.圖2 疑似病原菌的分離純化、血瓊脂培養基、革蘭氏染色和PCR電泳產物結果Fig.2 Isolation, purification, blood agar culture dish, Gram stain, and PCR electrophoresis products of suspected pathogenic bacteria

2.6 疑似病原菌人工回感試驗結果

從表3可見：疑似病原菌回感試驗第7天時，浸泡組死亡1 只；第13 天時，懸掛組死亡1只，浸泡組死亡2 只；第15 天時，懸掛組中6 只、浸泡組中5 只均出現陽性癥狀；第18 天時，懸掛組中3 只出現陽性癥狀，注射組中1 只死亡，浸泡組中3只出現陽性癥狀；持續至試驗第27天時，懸掛組中共10 只出現陽性結果(出現陽性癥狀和死亡)，注射組中僅1 只出現陽性結果(死亡)，浸泡組中共11只出現陽性結果(出現陽性癥狀和死亡)。陽性癥狀(圖4A～C)表現為角質層干裂和骨質層發黑，對照組均未發現陽性結果，整個試驗周期為27 d。這表明，這3種人工回感方式中浸泡感染效果最好。

選擇出現典型陽性癥狀的a2、d4及b6草龜樣本進行解剖，發現其均存在肝性腹水、淤血發黑、腫大等臨床癥狀，此外，a2和b6肝表面出現白色結節，a2肺部充血腫大。對腹甲、肝臟、肺組織中提取的細菌進行16S rDNA序列分析，得到與自然發病中華草龜相同的嗜水氣單胞菌，結果再次驗證了該菌是導致中華草龜腐皮裂甲病的病原菌。

表2 5株陽性菌的主要生理生化指標

圖3 PF-11菌株的16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of PF-11 strain

2.7 病原菌藥敏試驗結果

藥敏試驗結果表明：5 株菌株具有高度一致性，對頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、奈替米星、左氧氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星有強敏感性；對苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、阿莫西林、四環素等有耐藥性；對氯霉素抗菌藥中介(表4)。

表3 中華草龜腹甲腐皮干裂病疑似病原菌的人工回感試驗Tab.3 Results of artificial infection test for suspected pathogens of Chinese pond turtle Chinemys reevesiis

2.8 腹甲及主要內臟器官組織病理特征

從11只樣品龜中選取腹甲正常的9號樣品龜和腹甲角質層干裂、骨質層發黑的1號樣品龜，對其組織病理觀察顯示：9號樣品龜腹甲的病理特征為松質骨層中的骨髓腔浸潤大量的嗜酸性粒細胞，以出現炎癥為主，無結構壞死特征(圖5A、B)；1號樣品龜腹甲的病理特征為密質骨發生裂解壞死病變，以組織結構壞死為主，同時骨髓腔浸潤大量的嗜酸性粒細胞，有組織炎癥特征(圖5C、D)。對1號、9號樣品龜主要內臟器官組織病理觀察顯示：肺泡隔毛細血管高度擴張出血，肺泡腔中見大量炎性細胞(圖5E)；脾臟組織中有大量炎性細胞(圖5F)；腎臟組織出現嗜酸性結節(圖5G)；肝臟內炎性細胞增多，含鐵血黃素增多(圖5H)。

3 討論

3.1 中華草龜腐皮裂甲病病原的診斷

目前，有關龜鱉類體表疾病研究報道較多，但本研究病例中中華草龜腹甲出現角質層腐皮癥狀，與中華鱉[20-21]和黃喉擬水龜[22]腐皮病的臨床癥狀表現一致，與中華鱉的疥瘡病[23]、穿孔病[24]，以及與中華草龜、巴西龜、黃頭側頸龜的灰白甲病[5]及綠海龜灰白甲病[2]不一致，而腹甲骨質層變黑和角質層裂開的癥狀是發現的首例腹甲類新型疾病。

A—浸泡組a2腹甲干裂發黑部位(←)；B—浸泡組a5腹甲干裂發黑部位(←)；C—懸掛組dⅣ甲橋處出血部位(←)。A—the black part of the parched plastron in the immersion group a2 (←); B—the black part of the parched plastron of the immersion group a5 (←); C—the bleeding site at the dⅣ bridge in the suspension group (←).圖4 疑似病原菌人工回感健康中華草龜結果Fig.4 Artificial infection results of suspected pathogens to Chinses pond turtle Chinemys reevesiis

A、B—9號樣品龜，腹甲組織炎癥病癥，AOA—正常的松質骨層結構，AOB—骨髓腔浸潤大量的嗜酸性粒細胞，小圖示酸性顆粒細胞；C、D—1號樣品龜，腹甲組織結構裂解壞死病癥, AOA—正常的松質骨層結構，COB—由正常的松質骨層結構逐漸裂解過渡區, COC—松質骨層結構裂解壞死區；E—1號樣品龜，肺組織有大量炎性細胞；F—1號樣品龜，脾臟組織中有大量炎性細胞；G—1號樣品龜，腎臟組織出現嗜酸性結節，小圖示嗜酸性結節；H—1號樣品龜，肝臟組織中炎性細胞較多，鐵血黃素多。A and B—sample turtle No.9, inflammatory conditions of plastron tissue，AOA—normal cancellous bone structure，AOB—infiltration of a large number of eosinophils in the bone marrow cavity，and the inserted shows acidic granulocytes; C and D—sample turtle No.1, turbinated tissue structure of peritoneal necrosis, AOA—normal cancellous bone structure, COB—gradual cleavage transition zone from normal cancellous bone structure, COC—cleavage necrosis zone of cancellous bone structure; E—sample turtle No.1, with a large amount of inflammation in lung tissue cells; F—sample turtle No.1 has a large number of inflammatory cells in the spleen tissue; G—sample turtle No.1 has eosinophilic nodules in kidney tissue, the inserted—eosinophilic nodules; H—sample turtle No.1, liver tissues have more inflammatory cells, and hematoflavin.圖5 患病中華草龜腹甲及主要內臟器官組織病理切片(H.E染色)Fig.5 Histopathological section of plastron and main internal organs in diseased Chinese pond turtle Chinemys reevesiis(H.E staining)

本研究中，對從患病中華草龜提取的疑似病原菌進行16S rDNA基因序列比對及系統發育分析，結果顯示，該菌與嗜水氣單胞菌的一致性為100%。人工感染試驗中，健康中華草龜出現同樣癥狀，驗證了中華草龜腐皮裂甲病的致病菌為嗜水氣單胞菌，這與中華鱉腐皮病[25]和中華鱉腐皮疥瘡并發癥[23]的病原體結果一致，但與中華鱉的腐皮病病原為普通變形桿菌Proteusvulgaris[21]、產吲哚金黃桿菌Chryseobacteriumindologenes[26]，中華鱉穿孔病病原為摩氏摩根氏菌Morganellamorganii[27]，黃喉擬水龜腐皮病病原體為類香味菌新種Myroidessp.[22]，以及綠海龜灰白甲病病原體為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani結果[2]不一致。嗜水氣單

表4 中華草龜腹甲腐皮干裂病病原菌藥敏試驗結果

胞菌是可感染人和動物的重要病原，可感染水產動物并引發暴發性死亡。導致龜鱉腹甲感染的因素較多，而本研究中中華草龜腹甲腐皮裂甲病的病原體屬首次報道。

3.2 中華草龜腐皮裂甲病的病理診斷

本試驗中，中華草龜腐皮裂甲病的病理特征為腹甲骨髓腔浸潤大量的嗜酸性粒細胞、密質骨發生裂解壞死病變，這與中華草龜、巴西龜、黃頭側頸龜等寵物龜灰白甲病[5]病理結果一致，但骨髓腔未發現黑色素沉積。肝、肺、脾、腎內臟組織內浸潤大量嗜酸性粒細胞的炎癥特征與中華鱉腐皮病[28]、中華鱉穿孔病[29]的實質器官組織有炎癥病變一致，但與實質器官組織萎縮壞死且呈敗血癥的[29]病理結果不一致。

中華草龜腐皮裂甲病理機制是其腹甲先出現組織炎癥病癥，隨著病情嚴重，后期腹甲組織結構發生裂解壞死，表觀上一開始無明顯特征，中后期腹甲角質層開始裂開，骨質層開始發黑腐爛，最終死亡，這與裂甲后體腔開放進水有關。

3.3 中華草龜腐皮裂甲病的預防和控制建議

針對細菌性疾病研究，建議首先以預防為主，包括對生態環境的調控、中草藥的使用、疫苗接種等。建議使用抗生素為中華草龜腐皮裂甲病的主要治療方法。本試驗藥敏結果表明，該病致病菌對頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、奈替米星、左氧氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星等抗生素有強敏感性，這為該病的治療提供了科學依據，就近選擇以上為主成份的漁藥使用。但需注意的是嗜水氣單胞菌有一定耐藥性，這提醒實踐中應合理使用抗生素，嚴禁濫用，要嚴格遵循藥品說明書，避免增加抗藥性及藥物殘留等弊端，同時結合定期消毒，平時做好檢疫工作，使用復方中草藥及疫苗綜合防治該病，做好預防工作的同時還要“早發現，早治療”。