仁化縣貢柑主要病害的調查與檢測

（廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】貢柑Citrus reticulata blancovar.Gonggan（Deqing tribute orange）又稱“皇帝柑”或“貴妃橙”，有“中國柑王”之稱，它集中了橙類外形美和柑桔肉質細嫩、易剝皮的雙重優點，是南方優系柑橘地方品種，口感極佳，特別適合鮮食［1-2］。廣東省韶關市仁化縣位于南嶺山脈南麓，廣東省北部，粵、湘、贛三省交界地，屬于中亞熱帶南區，氣候溫和，雨量充沛，環境優良，適合種植貢柑。同時仁化縣貢柑主產區的土壤為丹霞地貌沖積形成的紅砂巖壤土，有機質含量較豐富，非常有利于發展貢柑產業［3］。目前，仁化縣已成為廣東省最大的貢柑產業基地［4］。據《廣東統計年鑒》報道，2003 年仁化縣柑橘類種植面積僅12942 hm2，年產量10.27 萬t；以后逐年增加，2018 年僅貢柑種植面積就達到約13333 hm2，總產量達35 萬t，總產值14.5 億元，占全縣農業總產值的48.2%，已經成為農民增收致富的重要支柱產業。【前人研究進展】柑橘黃龍病是世界性難防難治病害之一，目前還沒有抗性柑橘品種被發現和報道［5］。我國柑橘黃龍病菌主要由柑橘韌皮部細菌屬亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）引起，目前還不能被人工培養［6-7］。柑橘病毒病為柑橘生產上普遍發生的病害，能夠極大地減弱樹勢、減少產量和減低果品品質。據報道，我國目前主要有4 種常見的柑橘病毒病，分別為柑橘衰退病、柑橘裂皮病、柑橘碎葉病和柑橘黃脈病［8-10］。柑橘炭疽病和柑橘褐斑病是柑橘生產上重要的真菌病害，在我國，柑橘褐斑病報道于2007 年的重慶萬州紅橘上，主要為害柑橘葉片、果實和新梢；幼葉受害先出現褐色針頭狀大小的病斑，周圍有黃色暈圈；新梢發病時形成褐色不定形凹陷的褐色或黑色小點,而后繼續擴大，最后病斑以上新梢會變褐枯死；發病嚴重時會造成落葉落果，甚至枝梢枯死［11］；柑橘炭疽病可在柑橘葉片、枝梢、花、果上發生，同樣可引起落葉、枯梢、落果及儲藏期果實病害，對柑橘樹勢和產量、效益影響都很大［12］。但是關于仁化縣貢柑主要病害的調查和分析還未見詳細報道。【本研究切入點】為全面了解仁化縣貢柑果園病害發生情況，于2019 年4－10 月前往仁化縣3 個鎮（街道）4 個有代表性的貢柑果園進行柑橘病害的普查和分析。【擬解決的關鍵問題】通過調查研究，弄清楚仁化縣貢柑上的主要病害，以期為該地區柑橘病害的有效防治和柑橘產業的健康發展提供理論依據和指導價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品采集于2019年4月貢柑謝花掛果期和10月果實成熟期。主要調查仁化縣3個鎮（街道）4個貢柑果園，其基本情況見表1。調研時所采集的樣品（株）為果園的不同方位隨機采集，每個樣品為同一株樹不同方向上的若干枝條各采1～3個葉片或果實，優先采集枝條上具有黃化癥狀的葉片或果實。

表1 調查的4 個果園基本情況Table 1 Basic information of the four investigated orchards

1.2 試驗方法

1.2.1 植物DNA和RNA的提取、檢測及RNA的反轉錄 植物DNA和RNA的提取：每份DNA和RNA樣品均采集3～7個柑橘葉片的中脈或柑橘果實的果皮，用刀片切碎，而后用液氮快速將樣品磨碎，依次類推。每個樣品單獨用一副手套、一個研缽和研磨棒（使用前需對研缽和研磨棒進行高溫滅菌處理）。DNA的提取嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒為（AXYGEN）愛思進動植物基因組DNA制備試劑盒，具體提取方法見試劑盒說明書（Axygen Scientific Inc，美國）；RNA的提取主要采用天根生化科技有限公司的RNA提取試劑盒（貨號DP441，RNAprep Pure Plant Plus Kit），具體操作見試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）。

DNA 和RNA 的檢測：取2 μL 樣品在超微量紫外/可見分光光度計（Nano-100）儀器上進行檢測，讀取并記錄DNA 和RNA 的含量和質量數值。

RNA的反轉錄：具體操作見天根生化科技有限公司反轉錄試劑盒說明書〔貨號KR116 -02，FastKing RT Kit（with gDNAase）〕。

1.2.2 柑橘黃龍病的檢測 本研究采用實時熒光定量PCR（Quantitative PCR）的方法對貢柑葉片及果實中的黃龍病菌進行檢測。所有的檢測實驗均在ABI PRISM 7500（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）上進行。同時以柑橘黃龍病亞洲種的部分16S rDNA 序列為模板設計引物,引物的設計主要參照Li 等的方法：HLBas：5-TCGAGCGCGTATGCAA TACG-3，HLBr：5-GCGTTATCCC GTAGAAAAAGGTAG-3，利用探 針HLBp:5-6-carboxy -fluorescein（FAM）-AGACGGGTGA GTA ACGCG -Black Hole Quencher（BHQ）-1-3 對樣品進行檢測［13］。所用試劑為購自TAKARA 公司的Premix Ex Taq（Probe qPCR），所用引物和探針均合成于上海生工生物工程股份有限公司。實時熒光定量PCR 操作的具體體系（25 μL）為：12 μL Premix Ex Taq（Probe qPCR），0.5 μL HLBas/HLBr，1 μL HLBp，1μL DNA（50 ng/μL），10 μL ddw。具體程序為：95 ℃/30 s,40 個循環95 ℃/5 s～60 ℃/30 s。程序運行結束后，讀取Ct value 數值，以備后續分析。本團隊利用標準品做出來的Ct value 與菌含量的關系為：Y=-0.286X+11.924，其中X為Ct value 值，Y為拷貝數，每克植物組織中含有的病原菌拷貝數為10Y［14-15］。

1.2.3 柑橘病毒病的檢測 為了對仁化縣貢柑果園內的主要柑橘病毒病進行分析，本研究根據已報道的參考文獻中的檢測引物，重點對柑橘衰退病、裂皮病、碎葉病和黃脈病進行檢測。提取樣品的RNA并以其反轉錄的cDNA為模板，進行PCR反應，具體體系（20 μL）為:10 μL Premix Ex Taq，0.5 μL F/R，1μL cDNA（50 ng/μL），8 μL ddw；具體程序如下：95 ℃/5 min，35個循環94 ℃/30 s、54 ℃/30 s、72 ℃/1 min，然后72 ℃/5 min，16 ℃/forever。PCR結束后進行電泳，并對結果進行總結和分析。

1.2.4 病原菌的分離、致病性測定和分子生物學鑒定 病原菌的分離：由于在田間調查的過程中發現，每個果園都存在有不同程度的葉尖或葉緣褐變、葉枯和枝枯等現象。因此，我們在每個果園中選取3～4個枝條進行病原菌的分離，具體操作如下：選取發病的柑橘葉片和莖桿，用解剖刀在病健交界處取出0.2 mm2左右的小塊，依次在70%酒精中30 s、2%NaClO 2～3 min、無菌水沖洗3～5次，置于無菌濾紙上在超凈臺中晾干，最后放置于PDA培養基上25 ℃進行培養。培養3 d后，分離物上長出白色菌絲；培養7 d后，在顯微鏡下對分離所得菌株的菌絲和孢子進行鏡檢。

致病性測定：采用針刺和菌絲塊相結合的接種方法，分別在健康柑橘葉片上進行致病性測定；菌絲塊未針刺接種和空白PDA培養基接種作為陰性對照。

分子生物學測定：將單孢子培養7 d 的菌落從PDA 平板上刮下來，迅速用液氮研磨。而后依據Axygen 動植物基因組DNA 制備試劑盒的說明書進行DNA 的提取。選取核糖體轉錄間隔區（ITS）［ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'–TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'］為檢測引物，已提取的gDNA 為模板進行PCR擴增［16］。反應體系為:94℃ 3 min，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 30 s,36 個循環；72℃ 5 min 延伸。然后對得到的PCR 產物進行電泳檢測，將獲得的陽性PCR 產物進行測序。測序后的序列在NCBI上進行BLAST。

2 結果與分析

2.1 仁化縣柑橘黃龍病檢測結果

為了詳細了解仁化縣貢柑上柑橘黃龍病的發病情況，采用實時熒光定量PCR 檢測方法對采集自仁化縣不同果園共計150 個樣品進行貢柑黃龍病的檢測。結果（表2）發現，2019 年4 月4 個貢柑果園黃龍病檢出率為13.2%（6.7%～18.2%），2019 年10 月檢出率為31%（14.3%～87.5%）。而2019 年4 月份QRCR 檢測的Ct 值范圍為279.3～0，10 月份為6.09～0。具體表現為：采自丹霞街葛布村的陽性檢出率最低，黃坑鎮黃坑村的陽性檢出率最高。除來自黃坑鎮下營村的樣品黃龍病陽性抽檢率從4 月份的16.7%下降到10月份的14.3%外，其他果園4 月份的陽性抽檢率均低于10 月份的陽性抽檢率。值得注意的是，來自黃坑鎮黃坑村的失管果園，柑橘黃龍病的陽性檢出率就從2019 年4 月的18.2%上升到10 月的87.5%；丹霞街葛布村果園的陽性檢出率則從6.7%上升到14.3%。

2.2 仁化縣4 種主要柑橘病毒病的檢測結果

柑橘病毒病是柑橘生產上重要的病害之一，為了分析仁化縣貢柑上柑橘病毒病的為害情況，選用已報道的4種主要柑橘病毒病的相關檢測引物為引物，采集的150個樣品的cDNA為模板進行分析。結果（表3）表明，2019年4月在仁化縣4個貢柑果園均能夠檢測到衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV），檢出率為41.18%（33.33%～54.55%）；而裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）僅在丹霞街葛布村1個樣品中檢測到，檢出率為6.67%，其他果園均未檢測到；碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和黃脈病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）在4個貢柑果園中均沒有被檢測到。而在2019年10月的檢測中，4個果園均能夠檢測到柑橘衰退病毒病，檢出率為100%，其他3種病毒病在4個果園中均沒有檢測到。結果說明仁化縣的柑橘衰退病有一定程度的為害，而其他被檢病毒病則發生較低或沒有發生。

表2 仁化縣貢柑黃龍病檢測結果Table 2 Detection results of citrus Huanglongbing in Renhua County

表3 仁化縣貢柑病毒病檢測結果Table 3 Detection results of citrus virus diseases in Renhua County

2.3 其他主要真菌病害的調查和檢測

圖1 柑橘褐斑病和炭疽病復合侵染的田間癥狀和病原菌生物性狀Fig.1 Field symptoms and pathogenic biological characters under compound infection of citrus brown spot disease and citrus anthracnose

2019年4月和10月田間病害調查發現，4個果園中的柑橘植株均存在不同程度的葉尖或葉緣褐變，有的葉片上有褐色斑點，病斑不規則形；腋芽處發現淡褐色病斑，引起枯葉和枯枝的情況，病梢枯死，花穗變褐，引起落花，見圖1A。經病原菌分離，共分離到2種不同的真菌，見圖1B、D；2種真菌在PDA上最開始都長出白色菌絲，3～5 d后，真菌B的菌落呈現出灰色，并伴有大小不一的橙色孢子堆出現在上面；真菌D的菌落則完全變為灰黑色。在電子顯微鏡下觀察發現，真菌B的菌絲有分割和分叉，分生孢子卵圓形，且有明顯的油珠；真菌D的菌絲有分隔和分叉；分生孢子有喙和多個縱、橫隔膜。通過真菌通用引物ITS對真菌B和真菌D進行分子生物學鑒定發現，真菌B為炭疽屬真菌（Colletotrichumsp.），真菌D為鏈格孢屬真菌（Alternariasp.）（圖1B～G）。菌絲塊在健康柑橘（貢柑）葉片上回接試驗5 d后，分離所得的炭疽屬真菌和鏈格孢真菌能夠分別在健康柑橘上引起柑橘炭疽病和柑橘褐斑病的典型癥狀；但經過20 d后這2種真菌分別引起的癥狀與田間癥狀相似。這與過去的相關報道相一致：炭疽屬真菌主要引起柑橘炭疽病，鏈格孢屬真菌則引起柑橘褐斑病；而褐斑病和炭疽病在柑橘上的發病后期在癥狀上更多表現為混合感染、很難分辨。

3 討論

通過2019年4月和10月對仁化縣柑橘黃龍病的調查發現，除來自黃坑鎮下營村的樣品黃龍病陽性抽檢率4月份與10月份的幾乎相當外，其他果園的柑橘黃龍病陽性抽檢率4月份均低于10月份；尤其是黃坑鎮黃坑村的陽性抽檢率從18.2%上升為87.5%。造成這種巨大差異的原因，首先與采樣時期、病樹清理和栽培管理相關，有研究報道柑橘木虱的峰期集中在6月下旬至7月下旬、8月中旬至9月中旬、10月上旬至11月上旬，而木虱的大流行會加重柑橘黃龍病的發生［17-19］；其次是采樣造成的，由于單個柑橘植株上黃龍病菌的分布并不均勻［20］，尤其是黃坑鎮黃坑村的失管園已經毀園2年左右，2019年4月樹上仍有綠葉，而10月份全園果樹均呈現出衰敗的景象，葉片大部分黃化，果實極少。同時本研究在對該地區柑橘衰退病毒病進行檢測時也發現10月份其陽性檢測率達到100%，遠高于4月份的現象，這主要是由于采樣的優先選擇造成的，但是也從側面說明該地區的柑橘衰退病有一定程度的發生。

同時，由于采樣時優先選擇了黃化癥狀的樣品，則該地區柑橘黃龍病的實際發病率應低于20%，且含菌量較低，因此可以采取分類防控的技術措施進行綜合防控：加強以田間管理為重點的優質高產可持續發展的綜合防治措施，以農業防治為基礎，增施有機肥，實行配方平衡施肥，增施鉀肥，避免過量氮肥，改善土壤理化性狀，創造根系生長的良好環境。及時做好果園排灌工作，降低水田果園的水位，以增強樹勢，提高貢柑抗病力為關鍵，同時加強田間病情測和評估，及時噴藥防治，減少病原基數。具體措施如下：（1）對黃坑鎮黃坑村等處于失管狀態或每667 m2產量低于750 kg 或株產低于10 kg 的老舊或生長衰弱的貢柑園，徹底挖除病樹并火燒處理被挖樹體，進行徹底清園，重新進行整體規劃，重新種植無病貢柑種苗或改種其他植物；（2）對于丹霞街葛布村貢柑園、石塘鎮貢柑園、黃坑鎮下營村等貢柑園，應加強栽培管理，保持樹勢健壯，提高耐病能力，及時挖除病樹，挖樹前最好能對病樹及周圍貢柑樹噴施一次殺蟲藥劑，并火燒處理被挖樹體，并可在果園空缺的地方補種無病柑橘大苗;（3）需加強對貢柑種苗的檢測檢疫，培育種植無病苗木，保護新發展的種植區；尤其是加強對柑橘衰退病毒病的抽檢；（4）在生長期定期統一噴藥，統防統治黃龍病田間傳播媒介—柑桔木虱，重點減少成蟲產卵，殺死卵塊和低齡若蟲，遏制黃龍病傳播蔓延、減少黃龍病疫情危害。可在每輪新梢抽發2～3 cm 長及將轉綠時及時噴藥防治（即1 梢2 藥，間隔7～10 d）。藥劑可選用10%吡蟲啉乳油 2000～3000 倍液、3%啶蟲脒乳油 1000～1500 倍液、40%毒死蜱乳油1000～1500 倍液、25%噻蟲嗪水分散粒劑2500～3000 倍液、2.5%溴氰菊酯乳油2000～3000 倍液、8.8%阿維·啶蟲脒乳油 2000～4000 倍液、2.5%高效氯氰菊酯乳油 1000～1500 倍液、2.5%阿維·吡蟲啉乳油 2000～3000 倍液、2.5%魚藤酮乳油300～500 倍液、25%滅幼脲懸浮劑1000～2000倍液等［21-22］。

在對該地區其他病害進行調查和研究時發現，部分果園的零星柑橘葉片兩面突起，組織木栓化，中央凹陷破裂呈灰褐色火山口狀，且病斑版周圍有黃色暈圈，初步鑒定為柑橘潰瘍病，這可能與2019 年該地區多雨高溫的氣候相關［23-24］。同時發現，柑橘炭疽病和柑橘褐斑病在果園中的部分發病癥狀相似并難以分辨，后期癥狀幾乎一致；引起潰瘍病的Colletotrichumsp.和引起褐斑病的Alternariasp.，有的在病樣上被單一分離到，有的在病樣上同時被分離到。在對柑橘潰瘍病和柑橘褐斑病進行化學防治時，所選用的藥劑也不同。如防治柑橘炭疽病的二氰·吡唑酯、苯甲·錳鋅、硅唑·多菌靈、吡唑醚菌酯、苯甲·吡唑酯、咪鮮胺、氟硅唑、唑醚·代森聯、唑醚·甲硫靈、氟環唑、咪鮮胺錳鹽、唑醚·戊唑醇、嘧菌酯、氟啶胺、肟菌·戊唑醇、代森錳鋅等；目前在生產上還沒有防治柑橘褐斑病的登記殺菌劑，但可選用已登記防治柑橘炭疽病的殺菌劑進行兼治［25-26］；已登記防治柑橘潰瘍病的殺菌劑有王銅、氫氧化銅、喹啉銅、春雷喹啉銅、堿式硫酸銅、硫酸銅鈣、春雷王銅、枯草芽孢桿菌、中生乙酸銅、噻唑鋅、波爾多液、松酯酸銅、氧化亞銅、噻森銅、絡氨銅等［27］。因此我們建議仁化縣在進行柑橘病害防治時，選用同時防治多種病害的復合藥劑進行防控，不僅可增加對田間病害的有效防治，同時可延緩田間病害的抗藥性。

4 結論

仁化縣目前的主要柑橘品種為貢柑，且種植面積逐年擴大。通過對該地區失管果園柑橘黃龍病抽檢陽性率從18.2%上升到87.5%可以看出，在果園種植過程中及時挖除病樹和加強果樹栽培管理的重要性。同時該地區其他3個果園的柑橘黃龍病發病率應低于20%，因此，可通過加強以田間管理為重點的優質高產可持續發展的分類防控等綜合防治措施加強防控，盡量減輕黃龍病對柑橘產業的危害，延長柑橘園的豐產年限和生產壽命。同時該地區主要的柑橘病毒病衰退病毒病的發病率較高，從4月份的平均陽性抽檢率41.18%上升到10月份的100%，雖然有采樣的偏向性的原因，但也說明該地區柑橘衰退病有一定程度的發生；建議在種苗生產或種植前加強對貢柑衰退病毒病的檢測，在生產中加強防治。在對柑橘炭疽病進行防治的同時，要加強柑橘褐斑病等真菌病害及柑橘潰瘍病等細菌病害的防治，合理用藥，減少化學農藥用量。