異型葡枝霉感染不同金針菇后防御酶系的活性變化*

黃 靜，李長田，賈傳文，王曉敏，呂瑞娜

（吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

金針菇是我國主要的工廠化栽培食用菌之一，栽培范圍廣、產量大[1]。但在栽培過程中各類病害也經常發生，其中綿腐病（軟腐病）是常見的病害之一[2-3]。其致病菌是異型葡枝霉（Cladobotryum varium），為金黃菌寄生菌Hypomyces aurantius（Pers.）Tulasne的無性型[4]。在上世紀90年代中期金針菇常規生產中第一次出現綿腐病，普遍分布于我國南部和北部溫帶地區[5]。近年來，隨著栽培品種及氣候條件的不斷變化，綿腐病成為金針菇常規栽培和工廠化栽培的常見病害，對金針菇品質及產量造成嚴重影響。

異型葡枝霉以孢子形式侵染金針菇子實體；子實體感染初期由白色菌絲從子實體上吸取營養擴繁，致使菌柄變軟倒伏、后期變黃變黑至腐爛[6-8]。金針菇生長發育的各個時期均可被侵染，其中搔菌到出芽階段最易受侵染[9]。目前，對該病菌的防治主要依靠噴施殺菌劑，但長期使用會使異型葡枝霉的抗藥性增強且造成環境污染并增加生產成本，同時降低了金針菇鮮品品質[10-11]。

在逆境條件下，植物產生的活性氧自由基會破壞自身細胞膜和蛋白質等大分子物質，進而影響其正常生長發育，同時在逆境條件下植物體內存在的酶保護系統即抗氧化酶系統被激活可將其體內多余的自由基消除[12]。病原菌與寄主相互競爭與相互識別的過程中，寄主體內被迫產生高于正常水平的活性氧，打亂了正常代謝功能。過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶共同組成體內有效的活性氧清除系統，三者協同作用，可有效地清除植物體內過氧化物和自由基[13]。多酚氧化酶可將酚類物質氧化為對病原菌有毒的醌類物質，和植物的抗病性關聯密切，苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類代謝途徑中的限速酶和關鍵酶，為合成木質素和植保素提供前體，因此被作為植物抗病性的一個生化指標[14-15]。

目前，對綿腐病的研究主要集中在發生環境、生物學特性及防治等方面[16-17]，而對金針菇抗性機制方面卻缺少系統性研究。選育對異型葡枝霉具強抗性的金針菇品種是防治病害發生的最有效方法之一，因此深入研究金針菇的抗性機制具有重要意義。結合植物的抗病機制，試驗從病原物與寄主互作的角度出發，研究寄主被侵染后不同金針菇品種與4種防御系酶活性變化的關系，以期為金針菇抗病品種選育中生理生化指標的確定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試品種

金針菇L3002、L3003、L3005菌株來源于吉林農業大學食（藥）用菌教育部工程研究菌種保藏中心，病原菌異型葡枝霉（Cladobotryum varium）JZ-01為長春高榕公司金針菇菇房中具典型病狀的子實體分離所得，經柯赫氏法則驗證[18]，現保存于菌種保藏試驗室。

1.2 異型葡枝霉菌懸液的制備

異型葡枝霉菌絲24℃暗光培養5 d，表面產生大量孢子后，用移液槍吸取無菌水置于培養皿內，多次吸打。后吸取1 mL孢子懸濁液于9 mL的無菌蒸餾水中，混勻，后取1 mL于9 mL無菌蒸餾水中，反復此操作，直至血球計數板檢測菌懸液的濃度為1×106個/mL[19]。

1.3 接種及取樣

按金針菇工廠化的操作流程進行栽培及出菇管理[20]，在金針菇子實體長至瓶口時將配制好的異型葡枝霉菌懸液以噴霧式接種于金針菇柄部，以無菌水處理為對照，于接種第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天取樣后立即放入液氮中，移入-80℃冰箱中保存備用。

1.4 粗酶液提取與測定

采用試劑盒法（南京建成生物工程研究所：過氧化物酶試劑盒，多酚氧化酶試劑盒，苯丙氨酸解氨酶試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒）對4種酶進行測定，檢測方法按試劑盒說明書操作，每次測定重復3次取平均值。

1.5 數據分析

記錄所得的數據用SPSS 17.0軟件統計分析，將不同處理所得數據進行單因素顯著性分析，設定顯著性水平P為0.05，均值間不同小寫字母表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后PAL的活性變化

不同金針菇子實體苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性變化見表1、圖1。

圖1 不同金針菇子實體的PAL活性變化Fig.1 Changes of PAL activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

表1 不同金針菇子實體的PAL活性變化Tab.1 Changes of PAL activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表1、圖1所示，接種病原菌后，不同金針菇菌株的子實體內苯丙氨酸解氨酶PAL的活性均呈上升趨勢，且不同菌株上升趨勢不同。達到峰值的時間也不同。L3005的PAL最大峰值高于L3002和L3003。L3005的PAL酶活性在第5天時達到最大峰值，隨后PAL活性逐漸下降，L3005的PAL活性波動最大，最大酶活為 44.32 U·g-1min-1，是未接種時的3倍；L3003的PAL活性在第4天達到峰值為42.83 U·g-1min-1，是未接種的2.6倍；L3002的PAL活性波動最小，在第3天達到峰值其活性是未接種時的2倍。3個不同金針菇菌株的子實體內PAL活性與接種病原菌后的酶活性差異顯著（P＜0.05）。

2.2 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后PPO的活性變化

異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性變化見表2、圖2。

表2 不同金針菇子實體的PPO活性變化Tab.2 Changes of PPO activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

圖2 不同金針菇子實體的PPO活性變化Fig.2 Changes of PPO activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表2、圖2可知，不同金針菇菌株未經過接菌處理其子實體內的多酚氧化酶活性變化不大。接種后，不同金針菇菌株子實體內PPO酶活性均呈上升趨勢。接種病原菌后，L3005的PPO活性波動最大，第3天就達到最大峰值，為 40.92 U·g-1min-1，是其對照的 3.2倍；L3002和 L3003的波動相對較小。L3003的PPO活性第3天達到峰值 29.7 U·g-1min-1是其對照的 2.2 倍；L3002的 PPO活性第 4天達到峰值 27.72 U·g-1min-1，是其對照的1.89倍。接種處理后，3個金針菇品種子實體內PPO活性與其對照的酶活性差異顯著（P＜0.05）。

2.3 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后POD的活性變化

異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性變化見表3、圖3。

表3 不同金針菇子實體的POD活性變化Tab.3 Changes of POD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodie

圖3 不同金針菇子實體的POD活性變化Fig.3 Changes of POD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表3、圖3可知，金針菇未受病原菌侵染時，同一時期生長的3個菌株子實體內的過氧化物酶酶活變化不大，在同一水平上波動。接種病原菌后，金針菇子實體內的酶活發生變化，均呈上升趨勢。其中L3005和L3003的POD活性均在第2天達到峰值，L3002在第3天達到峰值。L3005和L3002的POD活性波動較大。L3005的最大酶活達到384.21 U·g-1min-1，是其對照的3.75倍；L3002的最大酶活為 341.57 U·g-1·min-1，是其對照的 3.17 倍；L3003 的POD活性波動相對較小，最大酶活為304.37 U·g-1min-1，是其對照的2.63倍。接種處理后，不同金針菇品種子實體內的POD活性與未接種處理的酶活性差異顯著 （P＜0.05）。

2.4 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后SOD的活性變化

異型葡枝霉侵染不同金針菇子實體后超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性變化見表4、圖4。

圖4 不同金針菇子實體的SOD活性變化Fig.4 Changes of SOD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

表4 不同金針菇子實體的SOD活性Tab.4 Changes of SOD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表4、圖4可知，不同金針菇菌株體內的SOD活性不同，波動不大。接種病原菌后，金針菇子實體內的SOD活性均呈上升趨勢。接種病原菌后，3個菌株均在3 d達到了最大峰值。且L3005的SOD活性偏高于L3002和L3003。L3005的SOD活性增幅最大，最大酶活為 729.63 U·g-1min-1，是其對照的 1.4倍；L3002 的最大酶活為 688.94 U·g-1min-1，是其對照的 1.3 倍；L3003 的最大酶活為674.91 U·g-1min-1，是其對照的1.26倍。接種處理后，3個金針菇菌株子實體內SOD活性與未接種處理的酶活性差異性顯著 （P＜0.05）。

3 討論

當生物被各類外源病原物侵染后，寄主細胞會調整自身體內生理生化和組織結構來適應外源物刺激以達到生存的目的，其中以參與各種代謝的防御酶類的活性變化最為明顯[21]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）均屬于寄主防衛系統的相關酶類，在某種程度上詮釋了寄主對病原菌的抗病程度，因此可以作為寄主抗病性的一個生理指標[22]。

異型葡枝霉菌侵染金針菇后，激活金針菇體內的主要防御酶系，使PAL、PPO、POD、SOD四種防御系酶的活性明顯增高。這與周春元[23]對雙孢蘑菇受濕泡病菌侵染后，雙孢蘑菇體內的酶活性升高結果一致，也和大多前人對其他作物的研究結果一致[24-25]。接種異型葡枝霉菌后，相比對照未接種的3個金針菇菌株子實體內的防御酶活性均有變化，出現最大峰值。其中，金針菇菌株L3005的PAL、PPO、POD、SOD活性均高于L3003和L3002。不同金針菇品種體內防御酶活性變化不同，說明4種防御酶在不同金針菇品種受異型葡枝霉侵染的抗性機制中發揮了一定作用。可通過對不同金針菇品種防御酶活性的測定，為篩選金針菇抗性品種提供一定的科學依據。

4 結論

同一生長時期金針菇子實體體內防御性酶活性差異不大，且酶活性波動趨勢相同。接種病原菌后，金針菇體內的酶活均有不同變化，且被病原菌侵染后一定時間內4種防御性酶的活力值均可達到峰值。金針菇接入病原菌后，其體內的酶活性與正常金針菇體內的酶活性差異顯著（P＜0.05）。其中，金針菇L3005的酶活性變化幅度均大于L3002和L3003，其活力值也偏高于二者。即金針菇L3005品種對異型葡枝霉菌的抗性更強。表明金針菇棉腐病的抗性和防御酶系之間相連密切，產生峰值前后時間可以作為金針菇抗病性的一個重要生理生化指標。