華麗牛肝菌菌塘土壤細菌多樣性的高通量測序分析*

伍 燕，杜俊希，張 娟，申利群

(1.興義民族師范學院，貴州 興義 562400；2.廣西民族大學 化學化工學院，廣西 南寧550006；3.廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西 南寧550006）

華麗牛肝菌（Boletus magnificus W.F.Chiu）屬牛肝菌科（Boletaceae）牛肝菌屬（Boletus），又名紅見手青、紅蔥牛肝菌，是一種味道鮮美、經濟價值較高的中小型牛肝菌[1]。在自然界，幾乎所有的牛肝菌都屬于外生菌根菌[2-4]，菌根與特定植物根系形成營養方式密切的共生體，牛肝菌大多以這種方式在生境中生存。目前，已實現人工栽培的牛肝菌是營養方式兼具腐生型的暗褐網柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）[5-6]；而美味牛肝菌 （Boletus edulis）、遠東疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale）和褐環乳牛肝菌（Suillus rubinellus）[7-10]均不能在人工培養條件下形成子實體。一方面是對牛肝菌與其宿主植物之間的關系和作用機制了解較少；另一方面是未充分了解牛肝菌生活環境的微生物群落豐富度和多樣性結構。

菌塘（shiro）是由牛肝菌的地下菌絲、宿主根系及周圍的腐質土壤結合形成的團狀結構，是牛肝菌菌絲體萌發和形成子實體的重要條件，對于牛肝菌這種經濟價值高且不能人工栽培的山珍，菌塘的生物學特性吸引了大量研究者進行相關研究。秦余等[11]運用新一代高通量測序技術對遠東疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale）、美味牛肝菌 （Boletus edulis）和小孢粉孢牛肝菌（Tylopilus microsporus）菌塘進行研究，發現這3種菌塘中的細菌以酸酐菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主；張舉龍等[12]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術對點柄乳牛肝菌（Suillus granulatus）菌塘研究發現，菌塘中變形菌門和酸桿菌門菌群的相對豐度較高，是其中的優勢菌群；郭霞等[13]研究還發現，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）對美味牛肝菌（Boletus edulis）菌根生長有促進作用。據《真菌詞典》記載，牛肝菌科是一大類，有35屬、26亞屬超過787種[14]，可食用牛肝菌約200種，由于對牛肝菌環境微生物組成和結構研究不多，目前對其菌塘生境也缺乏規律性認識。基于此，以華麗牛肝菌菌塘土壤為研究對象，采用高通量測序技術，結合生物信息學研究方法，對4個不同地區盛產牛肝菌采集點的土壤微生物群落特征進行研究，找出優勢菌群、分析共性，為下一步為華麗牛肝菌的人工栽培研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2019年8月分別在4個出產華麗牛肝菌的地點采集。興義倉更鎮（平均海拔1 013 m），板栗（Castanea mollissima Blum）樹下，記為XC；興義市烏沙鎮（平均海拔1 300 m），青岡林（Cyclobalanopsis glauca）下，記為XW；安龍縣海子鎮（平均海拔1 500 m），松木林（Pinus yunnanensis Franch.）下，記為XH；安龍縣新橋鎮（平均海拔1 200 m），青岡林下，記為XQ。每個地點選取3處華麗牛肝菌生長旺盛的菌塘，在距菌根2 cm半徑周圍處取土樣，土樣混合后放入4℃冰箱保存[15]。

1.1.2 藥品及試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒，美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，美國Life公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物技術有限公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技術有限公司；無水乙醇等試劑均為AR級，國藥試劑集團有限公司。

1.2 儀器和設備

Pico-21臺式離心機，美國賽默飛公司；Bio-Rad PCR擴增儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計，美國英杰生物技術有限公司；DYCZ-21電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源，北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱取200 mg土樣，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上清。加入1×磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上清，樣品干燥待用。

1.3.2 總DNA 提取和檢測

按照試劑盒 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit使用說明操作提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

1.3.3 PCR 擴增

1）擴增及純化

用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA準確定量，第一輪PCR以16S rRNA基因V3-V4通用引物進行擴增（341F:5′-CCCTACACGACGCTTTCC－GATCTG （barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3′;805R:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），擴增結束后對PCR產物進行檢測和純化[16]；第二輪PCR加入Illumina橋式PCR兼容引物擴增，對于細菌擴增的PCR產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物，選用0.6倍磁珠吸附（Agencourt AMPure XP）。

2）擴增條件

PCR擴增為30 μL體系：2×Taq masterMix 15 μL，341primerF 1 μL，805primerR 1 μL，基因組DNA 1 μL，用 ddH2O 補足至 30 μL。PCR 擴增條件為95℃預變性5 min；95℃反應30 s，45℃反應20 s，65℃反應30 s，5個循環；95℃反應20 s，55℃反應20 s，72℃反應30 s，20個循環；72℃延伸 5 min，轉為4℃保存[17]。

1.3.4 測序

PCR產物純化后，采用Illumina MiSeq第二代高通量測序平臺測定16S高變區域的序列，測序片段為雙向2×300 bp，委托上海生工完成測序。

1.3.5 數據分析

高通量測序序列（reads）通過拼接、過濾、去除嵌合體及非特異性擴增序列，使用QIIME軟件，繪制操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），依據OTU數目變化與聚類相似值之間的關系圖，從中選擇最佳的相似度值 （similarity）（＞0.97）進行OTU分析和分類學鑒定。每個OTU不少于120個有效堿基，每條OTU對應一種代表序列，基于16S RNA基因數據庫（RDP數據庫、Silva數據庫、NCBI 16S數據庫）對每一條OTU進行16S rRNA基因序列注釋。

2 結果與分析

2.1 菌塘多樣性指數（Alpha）分析

野生華麗牛肝菌生境見圖1。

圖1 野生華麗牛肝菌生境Fig.1 A wild fruiting body from Boletus magnificus

圖1為野生華麗牛肝菌生境，地點為興義倉更鎮，板栗樹下，此處平均海拔1 013 m，年平均氣溫16℃，氣候溫潤多雨。

Alpha多樣性指數分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其中表明群落分布豐度（community richness）的指數有Chao1和ACE，數值越大說明群落分布豐度好；Shannon和Simpson指數表明群落分布多樣性（community diversity），Shannon值越大或Simpson值越小，說明群落多樣性越高。各采集點菌塘土壤高通量測序數據質量分析結果見表1。

表1 菌塘土壤中細菌Alpha多樣性分析結果Tab.1 Analysis and results of bacteria Alpha diversity in shiroes soil

由表1可知，4個采集點的樣品通過高通量測序，共得到384 472條有效序列，樣本聚類得到31 502條有效OTU，樣品的覆蓋指數（coverage）＞0.94以上，覆蓋率高，能真實反映樣品的測序情況。XQ和XW的Chao1指數最高，說明樣本的菌群豐度最高；XC和XW的Shannon指數較高、Simpson指數較低，說明2個地點的菌群多樣性較豐富。不同土壤樣品中細菌的稀釋曲線見圖2。

圖2 不同土壤樣品中細菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterias in different soil samples

由圖2可知，4個樣品的稀釋曲線（rarefaction），shannon indexs指數呈直線上升，后趨向平穩，表明測序數據能覆蓋菌塘中絕大多數細菌信息，曲線在平滑穩定后產出的OTU數趨于穩定，其中樣品XH的Shannon指數稍低，說明該采集地的細菌多樣性較其他3個菌塘有一定差距。

2.2 各樣品中細菌類群的相關性分析

不同菌塘細菌基于OTU序列的聚類樹見圖3。

圖3 基于OUT序列的樣本聚類樹Fig.3 Clustering tree diagram based on OUT sequence

由圖3可知，XW和XQ聚成一類，并和XC在同一個簇上，XH位于較遠分支，直觀反映了不同土樣菌群的相似性和差異關系。不同土壤樣本主成分分析（principal components analysis，PCA）見圖4。

圖4 不同土壤樣本的PCA分析Fig.4 PCA analysis of different soil samples

由圖4可知，XW、XQ和XC散布在相鄰區域，XH在較遠的區域，反映了取樣生境不同，微生物菌群的差異性導致的差異。各樣品間OTU相關性韋恩圖見圖5。

圖5 不同樣品中細菌多樣性的相關性分析Fig.5 The similarity analysis of bacteria diversity in different soil samples

由圖5可知，XQ樣品中的細菌種類是8 882個、XW樣品中的細菌種類是8 580個、XH樣品中的細菌種類是6 481個、XC樣品中的細菌種類是7 559個；聚類關系比較近的XQ和XW共有的OTU數是2 080個，XQ、XW和XC三者共有的OTU數是1 151個，而4個樣品都共有的OTU數是818個，占OUT總數的7.05%；XQ、XW、XH和XC樣品分別與其他樣品發生重疊的數是3 350、2 897、2 544和 2 806個，分別占各自總數的 37.72%、33.76%、39.25%和 37.12%，反映了各自生境中土壤菌群的復雜性和共性。

2.3 菌塘中細菌組成分析

屬級水平上不同土壤樣品屬水平分類豐度統計見圖6。

圖6 不同土壤樣品屬水平分類豐度統計Fig.6 Relative abundance statistical figure of genus classification in different soil sample

由圖6可知，4個菌塘可鑒定細菌分屬于30個門78個屬，主要有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門 （Firmicutes）、擬桿菌門 （Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和放線菌門（Actinobacteria）等。

2.3.1 XQ 菌塘細菌分類

變形菌門占69.06%，下屬主要有伯克氏菌屬（Burkholderia，46.92%）、哈夫尼菌屬 （Hafnia，12.19%）、緩生根瘤菌屬 （Bradyrhizobium，5.32%）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，2.63%）；酸酐菌門占 15.81%，下屬主要有 Gp1（8.89%）、Gp2（4.95%）和 Gp3 （1.97%）；芽單胞菌門主要是芽單胞菌屬 （Gemmatimonadetes，2.22%）；此外還有WPS-1 genera incertae sedis（1.07%）和 WPS-2 genera incertae sedis（1.36%）。

2.3.2 XW 菌塘細菌分類

變形菌門占58.34%，下屬主要有伯克氏菌屬（Burkholderia，41.51%）、鞘氨醇單胞菌屬 （Sphingomonas，11.08%）和緩生根瘤菌屬 （Bradyrhizobium，2.75%）；酸酐菌門占24.04%，主要的屬有Gp1（15.39%）、Gp2（4.26%）和 Gp3（4.39%）；芽單胞菌門主要是芽單胞菌屬（Gemmatimonadetes，5.69%）；此外有 WPS-1 genera incertae sedis（2.32%）和WPS-2 genera incertae sedis（3.21%）。

2.3.3 XC 菌塘細菌分類

酸酐菌門占 62.39%，下屬主要有 Gp1（49.09%）、Gp2 （5.09%）和 Gp3 （8.21%）；變形菌門占 14.70%，主要的屬有鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，11.64%）、緩生根瘤菌屬 （Bradyrhizobium，2.17%）和伯克氏菌屬（Burkholderia，0.89%）；芽單胞菌門主要是芽單胞菌屬 （Gemmatimonadetes，5.07%）；此外有 WPS-1 genera incertae sedis（7.51%）和WPS-2 genera incertae sedis（7.42%）。

2.3.4 XH 菌塘細菌分類

變形菌門占72.13%，主要的屬有沙雷氏菌屬（Serratia，65.23%）；酸酐菌門占 2.97%，主要有Gp1（1.31%）和 Gp6（0.92%）；此外還有 WPS-1 genera incertae sedis（9.07%）。

2.4 基于屬水平的優勢細菌分析

在屬水平上，把4個菌塘中相對豐度在5%以上的細菌列為優勢菌，統計結果見表2。

表2 4個樣品中優勢細菌及相對豐度Tab.2 Dominant bacteria and relative abundance of 4 samples

由表2可知，4個菌塘中的優勢菌各有特點，XQ和XW菌塘含有大量伯克氏菌屬（46.92%～41.51%，Burkholderia），這2個菌塘位于青岡林下屬于原生態環境，人類活動較少，生境大致相同，優勢菌群均是以固氮菌和解鉀為主的伯克氏菌屬；XC取樣于板栗林下，人工打藥、施肥活動頻繁，Gp1含量較高（49.09%），據王繼玥等[18]對Pb污染后的三葉草土壤細菌多樣性變化分析認為，Pb污染會導致土壤環境中酸酐菌門的Gp1含量增高，菌群結構發生改變，推測是人類活動使得倉更當地土壤重金屬、農藥有殘留，導致Gp1含量升高；在XH菌塘中沙雷氏菌屬（Serratia，65.23%）占比較高，可能因松林樹種單一，土壤微生物多樣性呈下降趨勢，加之人為干擾等原因使得該松林中磷肥含量偏多，與解磷作用相關的沙雷氏菌屬含量比較高[19]。此外，哈夫尼菌屬（Hafnia）、Gp2、緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonadetes）、WPS-1 genera incertae sedis和WPS-2 genera incertae sedis在相應菌塘中豐度也較高。對4個菌塘中相對豐度前48個屬的細菌進行熱圖-聚類分析，不同顏色代表豐度的高低，越紅說明豐度越高，分析結果見圖7。

圖7 不同土壤樣本屬分類豐度熱圖Fig.7 Relative abundance heatmap of genus classification in different soil sample

由圖7可知，從橫向看，4個菌塘中豐度較高的是變形菌門和酸酐菌門，優勢菌排前三的是伯克氏菌屬、Gp1和沙雷氏菌屬。從縱向看，XW菌塘細菌多樣性較好，紅色和淺紅色貫穿在48個屬中，其次是菌塘XQ和XC，XH菌塘因沙雷氏菌屬的比例高導致菌群結構多樣性簡單。

3 結論

采用高通量測序技術對華麗牛肝菌4個菌塘細菌分析認為，4個菌塘中變形菌門、酸桿菌門是主要的細菌類群，在XW（烏沙）和XQ（新橋）菌群中，變形菌門的伯克氏菌屬是優勢菌；XC（倉更）菌群中，酸桿菌門的Gp1是優勢菌；XH（海子）菌群中，變形菌門的沙雷氏菌屬是優勢菌。可見，各菌塘優勢菌主要集中在固氮力較強和分解有機磷、鉀的菌，且優勢菌屬集中在變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和硬壁菌門，同時WPS-1 genera incertae sedis和WPS-2 genera incertae sedis在菌塘中也占一定比值，表明牛肝菌生長的土壤環境主要由這些菌群組成，研究結果為華麗牛肝菌的人工馴化栽培提供了參考。

4個菌塘細菌豐度的差異與取樣的環境、樹種、土壤的特質和人類活動有關[20]。通過對華麗牛肝菌菌塘細菌類型的研究，發現人類活動多，例如施肥、打藥的地方和人類活動少的地方相比，菌塘的菌群種類在多樣性結構方面有較大差異。如XW和XQ菌塘都采自青岡林，人類活動干擾少，二者細菌組成和多樣性相差不大；XC和XH菌塘分別采自板栗林和松林，二者的細菌組成和多樣性都有差異，雖然這種微生物層面的變化對當地野生食用菌的產量和交易量影響較小，但對野生食用菌的品質如農藥殘留、重金屬超標有一定影響[21]，因此，注意保護當地生態環境，保護野生牛肝菌的種類和產量在未來是重要的任務。