不同品種靈芝多糖得率及其體外抗氧化活性的差異研究*

張學新，劉子寧，王玉茜，楊 悅**

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018）

靈芝 （Ganoderma lucidum），屬于擔子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）靈芝菌科 （Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma）[1]，是一種珍貴的藥用真菌。中國是最早人工栽培和利用靈芝藥用價值的國家，《神農本草經》中就有關于赤芝的記錄，其性質溫和，可以補中氣，延緩衰老，對記憶力有改善效果，故又有“芝草、仙草”之稱[2]。靈芝中含有很多對人體有益的生物活性成分及營養成分，如多糖[3]、三萜類化合物[4]、礦物質[5]、蛋白質、氨基酸[6]等，具有提高人體免疫力、抗氧化、保護修復消化系統、改善血液循環等作用[7]。目前很多行業已經開始研究和推出與靈芝有關的產品，如靈芝膠囊、靈芝茶和靈芝精華等。

多糖（polysaccharide）是一類由糖苷鍵連接單糖而成的天然高分子碳水化合物，在維持生物基礎活動中起著重要作用，可以參與人體內的細胞代謝及生理調節過程。多糖在自然界中廣泛存在，依據來源可分為動物多糖、植物多糖和真菌多糖[8]。不同生長區域的空氣條件、土壤條件和光線等都會影響靈芝中多糖的含量[9]。泰山靈芝多糖得率最多可達1.58%，龍泉產粉靈芝多糖可達2.18%，佳木斯的云頭狀靈芝多糖最多為1.58%，廣州靈芝多糖可達1.61%，韓國靈芝多糖最多可到1.91%，日本赤靈芝多糖可到1.34%[10]。多糖的生物活性主要取決于其特定的空間結構，包括一級結構和高級結構，其中高級結構對多糖功能的影響較大[11]。由于特殊的β-二股繩狀螺旋型立體構型，多裂褶多糖有抑制腫瘤的作用，然而某些特別的物質如尿素，會改變多糖分子構型從而導致該作用受損或完全喪失[12]。除葡萄糖外，從靈芝中提取的多糖還有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等[13]。作為靈芝中的主要生物活性成分，多糖有著抗腫瘤、免疫調節、抗輻射、抗氧化等多種重要作用[14-15]。

靈芝作為一種可食用真菌，已經進入我國藥食同源原料目錄，其重要的生物活性已經得到人們的關注和認可。靈芝多糖是靈芝中的重要活性組分，為了對其最大化的開發和利用，一些先進的物理技術已經應用于對其結構和生物活性功能的研究[16-18]。國內外靈芝品種繁多，不同品種靈芝子實體的外觀形態以及多糖含量各不相同。通過測定12個不同品種靈芝多糖的含量及體外抗氧化能力，并對產量最高的靈芝粗多糖結構進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

12個靈芝品種，均來自山東省泰安市農科院食用菌研究所，分別為日本進口（1號）、泰山野生型（4號）、泰山野生型（8號）、泰山野生型（64號）、泰山野生型（76號）、韓芝（14號）、鹿角靈芝（18號）、泰山1號（20號）、紫芝（31號）、紅芝（32號）、樹舌（40號）、樹舌（42號）。

無水乙醇、葡萄糖、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、三氯化鐵，天津市凱通化學試劑有限公司；抗壞血酸（VC），天津市致遠化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海華藍化學科技有限公司；1,1-2,6-二叔丁基對甲酚（BHT），上海源葉生物有限公司；三氯乙酸、硫酸亞鐵、正丁醇、氯仿、溴化鉀，天津市巴斯夫化工有限公司。

1.2 試驗儀器

FW-135中藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9011A恒溫干燥箱，海精宏實驗設備有限公司；TCX-200S數控超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；NicoLet iS 10型紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1 靈芝粗多糖的提取與得率測定

利用超聲波輔助水提法[19]，將靈芝子實體放于烘箱中80℃烘至恒重，用中藥粉碎機打碎，過80目篩得到靈芝粉末。稱取1.5 g靈芝粉末放入燒杯中，以粉末和液體比1∶50加水；250 W、80℃超聲波輔助提取40 min，將超聲后的液體4 000 r·min-1離心5 min；取上清液，加95%乙醇溶液至乙醇體積分數為 75%，搖勻，4℃過夜。4 000 r·min-1離心 15 min，棄上清液，沉淀用去離子水溶解并轉移至容量瓶中加水定容至100 mL。每個樣品如此重復操作，得到不同品種的多糖樣液，每個樣品設3個重復。

采取苯酚-硫酸法[16]測定多糖得率，取6支試管，編號 1～6，分別加入 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 的 100 μg·mL-1葡萄糖標準溶液，后補充去離子水至2 mL，得到濃度分別為0、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1、40 μg·mL-1、50 μg·mL-1的葡萄糖待測液；再分別加入1 mL 5%苯酚溶液，充分混合，沿內壁緩慢加入5 mL濃硫酸，快速充分搖勻，于室溫條件下靜置20 min后，測定各組溶液在490 nm處的吸光度值。根據濃度和所得數據繪制葡萄糖濃度-吸光度值標準曲線。每個濃度設3個重復。

準確吸取不同樣品2 mL多糖溶液于各個試管中，重復上述試驗步驟，測定混合液在490 nm波長處的吸光度值，依據不同樣品溶液的吸光度值和繪制的標準曲線計算靈芝多糖得率。多糖得率（Y,%）計算公式為：

式中：C表示樣本液多糖濃度（μg·mL-1）；V0表示顯色液總體積（mL）；V1表示靈芝多糖樣液的總體積（mL）；V2表示顯色步驟中添加的多糖樣液的體積（mL）；M表示稱取的靈芝粉末的重量（1.5 g）。

1.3.2 靈芝粗多糖體外抗氧化活性的研究

取不同種類的多糖樣液各2 mL，向其中加入2 mL的0.2 mmol·L-1DPPH溶液，充分搖勻，于室溫下遮光放置15 min，4 000 r·min-1離心15 min。測定上清液在517 nm波長下的吸光度值[20]。以2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）和抗壞血酸（VC）為陽性對照試驗，重復上述步驟，測定吸光度值。每個樣品設3個重復。DPPH自由基清除率（D，%）計算公式為：

式中：A0表示2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇的吸光值；Ai表示2 mL DPPH溶液+2 mL樣品液的吸光值；Aj表示2 mL樣品液+2 mL95%乙醇的吸光值。

精確量取1 mL多糖樣液，向其中依次加入2.5 mL磷酸緩沖液和1.0 mL鐵氰化鉀溶液，充分混合后在50℃水浴鍋中加熱反應20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液，混勻后放入離心機，2 000 r·min-1離心10 min。取2.5 mL上清液，向其中加入0.5 mL三氯化鐵溶液和2.5 mL去離子水，充分混勻，在室溫條件下靜置10 min，測定混合液在700 nm波長時的吸光度值[21]。以VC為陽性對照，重復上述試驗步驟并測定吸光度值。每個樣品設3個重復。

1.3.3 靈芝粗多糖的分離純化與理化分析

采用sevag法[22]除蛋白，在樣液中加入約為其體積1/3的sevag試劑，震蕩20 min后靜置，4 000 r·min-1離心5 min，取上層液體并去除交界處白色的變性蛋白質。為完全去除蛋白質，需要多次重復操作，直到離心后溶液交界處不再有白色沉淀出現。每個樣品設3個重復。

在脫蛋白多糖溶液中加入1.5%活性炭，進行脫色處理[23]；在水浴鍋中58℃加熱30 min，不斷攪拌，抽濾，向濾液中加入80%乙醇靜置12 h；離心，去除活性炭，將剩余沉淀用無水乙醇進行多次洗滌，放入烘箱內干燥即得到精制多糖。每個樣品設3個重復。

取1 mg精制多糖，與100 mg溴化鉀混合，在瑪瑙研缽中研磨10 min，在紅外光譜儀中進行壓片分析。測量紅外光譜范圍為400 cm-1～4 000 cm-1。測定前先不加樣品，建立溴化鉀背景基線掃描。每個樣品設3個重復。

2 結果與討論

2.1 不同品種靈芝粗多糖得率的測定

2.1.1 葡萄糖標準曲線

試驗所得葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，線性回歸方程：y＝0.014 3x+0.008 1，R2＝0.999 4，表明在 0～50 μg·mL-1的線性范圍內葡萄糖濃度與吸光度有良好的線性關系。

2.1.2 多糖得率

多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖，迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成棕黃色化合物[16]。多糖濃度及得率得率見圖2，不同品種靈芝的吸光度見表1。

圖2 不同靈芝品種的多糖得率Fig.2 Polysaccharide yield of different Ganoderma lucidum species

表1 不同品種靈芝的多糖吸光值Tab.1 Absorbance values of different Ganoderma lucidum species

由圖2及表1可知，不同品種的靈芝多糖得率不同且差距較大，但試驗中所測定的12種不同品種的靈芝多糖得率均在0.6%～2.6%。得率最高的是日本進口樣品（1號）為2.590%，鹿角靈芝樣品（18號）的多糖得率為2.090%；多糖得率最少的32號樣品為0.604%，為1號樣品多糖得率的約1/4。

2.2 不同品種靈芝粗多糖抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除率測定

DPPH自由基的清除率可評估其抗氧化性強度[24]，不同品種靈芝的DPPH清除率見圖3。

圖3 不同品種靈芝的DPPH清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rate of different Ganoderma lucidum species

由圖3可知，陽性對照組VC在5 mg·mL-1時的清除率為95.3%、甲酚（BHT）在5 mg·mL-1時的清除率為95.0%。不同品種靈芝多糖的DPPH清除率也有所不同，12種靈芝多糖樣品清除率在54%～95%。其中，清除率最高的是日本進口樣品（1號），為95.0%，鹿角靈芝樣品（18號）其次，清除率為89.4%，可推斷2種樣品有較好的抗氧化能力；紅芝樣品（32號）清除率最低，為54.9%。

2.2.2 還原能力測定

抗氧化物可以通過提供電子阻礙Fe3+和鐵氰復合物形成亞鐵離子的形式，從而實現還原能力[25]，通過不同多糖樣液反應后的吸光度值表示其還原能力，即其抗氧化能力，其還原能力數據統計見圖4。

圖4 不同品種靈芝的還原能力Fig.4 Reducing power of different Ganoderma lucidum species

由圖4可知，靈芝多糖具有一定還原能力，日本進口樣品（1號）的還原能力最高，為0.417，其次為鹿角靈芝樣品（18號）還原能力為0.387；紅芝樣品（32號）的還原能力最低，為0.207。

2.3 結構解析

基于以上試驗結果，選擇多糖得率最高的1號樣品，經分離純化后在波長400 cm-1～4 000 cm-1對其進行紅外光譜分析，其紅外光譜見圖5。

圖5 1號樣品靈芝多糖的紅外光譜Fig.5 IR spetra of NO.1 Ganoderma lucidum polysaccharide

由圖5可知日本進口樣品（1號）多糖的紅外吸收光譜在 3 237.30 cm-1、2 926.14 cm-1、1 617.34 cm-1、1 420.29 cm-1、1 074 cm-1等多處有明顯的多糖特征譜帶。O-H鍵的伸縮振動導致3 237.30 cm-1附近出現吸收峰；2 926 cm-1附近的吸收峰是由于C-H鍵的伸縮振動；1 617.34 cm-1附近的吸收峰是由結合水引起的；C-O鍵的伸縮振動引起1 420 cm-1附近的吸收峰，而出現在1 034 cm-1附近的吸收峰是吡喃環非對稱環伸縮振動引起的，這些都是糖類的特征鍵[26]。

3 結論

通過超聲輔助水提法提取靈芝多糖并測定其得率，對其進行體外抗氧化能力的測定，對日本進口（1號）靈芝粗多糖進行分離純化，對結構表征進行初步研究。結果顯示，所測不同品種的靈芝多糖得率不同，日本進口樣品（1號）得率最高，為2.59%；紅芝樣品（32號）的多糖得率最低，為0.604%。不同品種靈芝多糖的抗氧化效果也不同，其中日本進口（1號）多糖樣品的抗氧化性最強，DPPH自由基清除率為94%，還原力為0.417，其次為鹿角靈芝（18號）樣品，其DPPH自由基清除率為89.4%，還原力為0.387；32號多糖樣品的抗氧化性最弱，清除率為0.549%，還原力為0.207。將多糖得率最高的1號樣品的靈芝粗多糖進行分離純化，所得的精制多糖經紅外光譜分析，得出多糖的結構，該多糖具有C-H鍵、C-O鍵、-OH等多種典型的多糖特征鍵。

靈芝多糖具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等藥理作用，可應用于食品和醫療保健行業。對不同品種靈芝多糖得率的測定及其體外抗氧化活性的差異進行研究，對于靈芝多糖的利用以及提取靈芝多糖時對不同品種靈芝的選擇提供了技術支持。未來可繼續對不同品種靈芝的組成結構進行深入研究，以建立更為詳盡的評價體系，為靈芝多糖的利用提供理論依據。