高原線蟲草重寄生菌的鑒定及培養(yǎng)*

馮云利，陳 惠，陳正啟，鄭慧華，方 媛，華 蓉，郭 相，孫達鋒**

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

多頭霉屬（Polycephalomyces），屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）線蟲草科 （Ophiocordycipitaceae）[1]。多頭霉孢梗束初白色，老時為棕色，頂端有黃色粘液分生孢子團，分生孢子小，產(chǎn)孢瓶體末端瓶梗錐形或逐漸變細[1-3]。該屬真菌寄主眾多，可寄生于膜翅目、鱗翅目、脈翅目、半翅目等昆蟲，以及重寄生于其他蟲生真菌、黏菌、大團囊菌等[4-5]。

對采自云南省嵩明縣梁王山的高原線蟲草子實體基部的白色菌絲體進行分離培養(yǎng)，并通過菌絲體的形態(tài)學觀察與ITS序列分析確定其分類地位。此次研究對了解和保護物種多樣性及開發(fā)和利用蟲草生物資源具有重要的理論意義，也為蟲生真菌重寄生菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試子實體

2015年7月于云南省嵩明縣梁王山采集高原線蟲草（Ophiocordyceps highlandensis）子實體，子實體標本保藏于中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所標本館，編號為KEFI-08742。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）PDA綜合培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、蛋白胨1 g、酵母粉1 g、葡萄糖20 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g、瓊脂 15 g，水1 000 mL，pH自然。

2）液體培養(yǎng)基

葡萄糖 5 g、蛋白胨 15 g、KH2PO41.5 g、MgSO40.75 g，加水至1 000 mL，pH 自然。

2）固體培養(yǎng)基

配方A：每瓶大米45 g；配方B：每瓶小麥45 g；配方C：每瓶大米22.5 g和小麥22.5 g。各配方添加液體培養(yǎng)基 58.5 mL（料液比為 1∶1.3）。

1.2 試驗方法

1.2.1 重寄生菌的分離純化

用無菌接種針刮取高原線蟲草子實體基部白色菌絲，劃線于含青霉素的PDA試管，25℃培養(yǎng)，經(jīng)過多次純化后得到純培養(yǎng)菌株，編號JZ025。

牛血清白蛋白(上海市源聚生物科技有限公司)；考馬斯亮藍G-250、Na2HPO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4、95%乙醇、85%磷酸均為分析純。

1.2.2 重寄生菌的形態(tài)學鑒定

將分離純化的重寄生菌打孔轉(zhuǎn)接至PDA平板，25℃培養(yǎng)20 d。進行顯微形態(tài)拍照，并測量菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子大小。

1.2.3 分子生物學鑒定

將純化后菌絲體用試劑盒（TaKaRa生物有限公司）提取DNA，-20℃保存于冰箱。選用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進行 ITS 區(qū)域擴增[6-7]，引物由華大基因合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有清晰明亮條帶的樣品交由昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，將所測的ITS序列編輯后在NCBI上進行BLAST在線比對，確定其分類地位，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.2.4 重寄生菌的固體培養(yǎng)基篩選

按照1.1.2配置好3種固體培養(yǎng)基，121℃滅菌1 h，冷卻后在無菌室紫外燈消毒殺菌30 min；用已滅菌直徑5 mm打孔器均勻截取4℃保存的JZ025菌株菌絲塊接種，25℃培養(yǎng)，每個處理5個重復(fù)。記錄菌絲封瓶時間、孢梗束生長情況，培養(yǎng)40d后收取孢梗束進行稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 高原線蟲草重寄生菌形態(tài)學鑒定

圖1 高原線蟲草子實體照片F(xiàn)ig.1 Fruiting bodies of Ophiocordyceps highlandensis

由圖1可知，標本KEFI-08742，高原線蟲草寄主為鰓金龜，1.5 cm×0.8 cm；形態(tài)描述參考李玉等[9-10]的方法，子座長 4.0 cm～8.5 cm，暗褐色至黑色，單生，圓柱形或近梭形，從寄主頭部長出，不分支。不孕部分長3.0 cm～4.8 cm，暗褐色，與寄主頭部相連；可孕部梭形，1.0 cm～2.5 cm。重寄生菌生長于不孕柄基部，白色，絨毛狀。重寄生菌菌落菌絲PDA培養(yǎng)情況見圖2。

圖2 重寄生菌的菌落PDAFig.2 Colonies of the mycoparasite on PDA

由圖2可知，重寄生菌在PDA培養(yǎng)基上生長良好，在25℃下，培養(yǎng)10 d封皿，初期白色，絨毛狀；變老時菌絲密集，中央白色帶粉紅色，后期變?yōu)辄S色。培養(yǎng)15 d開始長孢梗束，培養(yǎng)20 d可見肉色液體溢出；背面橙黃色，四周顏色逐漸變淺，變?yōu)辄S色。孢梗束棍棒狀，長4 cm～7 cm，初為白色，后變?yōu)榈S色，頂端產(chǎn)生不透明的黃色分生孢子團。其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和β-型分生孢子，孢梗束頂端的α-型分生孢子和分生孢子鏈顯微特征見圖3。

圖3 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子顯微形態(tài)Fig.3 Conidiogenous structure and conidia

由圖3a、圖3b可知，重寄生菌菌絲透明，具隔，分枝，寬 1.8 μm～3.0 μm，瓶梗頂側(cè)生、單生、對生或互生，矛尖形或細燒瓶型，頸部狹窄，直接產(chǎn)生于氣生菌絲和孢梗束外圍的菌絲，有時產(chǎn)生于單個分生孢子梗；產(chǎn)孢瓶體細長，（15.0 ～25.0）μm×（0.2～0.5）μm，向基式產(chǎn)生鏈狀的分生孢子。

由圖3c～圖3e可知，重寄生菌分生孢子無色，透明，單胞，α-型分生孢子卵圓形至長橢圓形，（3.0～4.0）μm ×（1.0～1.5）μm，產(chǎn)生于孢梗束頂端的分生孢子團；β-型分生孢子紡錐形，（3.2 ～4.5）μm×（1.3～2.0）μm，產(chǎn)生于孢梗束柄部和菌落的表面菌絲[3]。

2.2 高原線蟲草重寄生菌ITS序列分子鑒定

JZ025為重寄生菌ITS，經(jīng)BLAST比對，選用另外7條GenBank下載序列應(yīng)用軟件MEGA 7.0基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；包括中國多頭霉（Polycephalomyces sinensis NR-119928）、枝多頭霉（Polycephalomyces ramosus AB925944）、枝多頭霉 （Polycephalomyces ramosus MK86325）、Ophiocordyceps neovolkiana HM 856642、Ophiocordyceps neovolkiana HQ215593以及外群序列Cordyceps nipponica JN 943303和 Cordyceps nipponica JN943442。基于 ITS序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖4可知，JZ025與數(shù)據(jù)庫中Polycephalomyces sinensis NR-119928序列以91%的支持率聚在一支上，且在NCBI上比對的相似度達到98.8%，并與屬內(nèi)其余種相差較大，推測其為同一個種。結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果將菌株JZ025綜合鑒定為中國多頭霉（Polycephalomyces sinensis）。

2.3 重寄生菌的固體培養(yǎng)基篩選

菌株JZ025的菌絲在25℃培養(yǎng)40 d后進行觀察，其生長情況見圖5，在3種固體培養(yǎng)基中的生長狀況統(tǒng)計見表1。

表1 不同培養(yǎng)基配方對孢梗束生長的影響Tab.1 Effect on the synnemata growth conditions in different solid cultured medium

圖5 固體培養(yǎng)Fig.5 Solid cultured medium

由圖5、表1可知，菌絲培養(yǎng)20 d～25 d封瓶，并開始產(chǎn)生孢梗束，JZ025菌株菌絲在配方A中生長得最好，封瓶時間及孢梗束長出時間最短，且菌絲體生物量最大，達4.500 g。

3 結(jié)論

多頭霉屬是1941年Kobeyasi建立的單種無性型屬，模式種為美麗多頭霉P.formosus Kobayasi[11]。該屬真菌存在重寄生現(xiàn)象，即寄生物再寄生于其他寄生物。到目前為止，文獻報道多頭霉屬有28個種，其中16個種報道具有重寄生現(xiàn)象[3]。其中枝多頭霉（P.ramosus）重寄生較多，可重寄生于巴恩斯蟲草（Cordyceps barnesii）和蟲根蟲草（Cordyceps entomorrhiza）[12]、下垂蟲草 （Ophiocordyceps nutans）[13]。中國多頭霉可寄生于蝙蝠蛾科幼蟲以及冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）菌核或子座部分，并能夠成功獲得其培養(yǎng)物[3]。

分離純化得到的菌株JZ025，通過形態(tài)觀察，并結(jié)合ITS序列數(shù)據(jù)分析，確定其為中國多頭霉；同時獲得其純培養(yǎng)物，并進行最適培養(yǎng)基的篩選。中國多頭霉可重寄生于高原線蟲草，為重寄生于新真菌。后續(xù)試驗可開展其成分分析等方面的研究，以加深對該重寄生菌的認識，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。