黑木耳高溫脅迫條件優化研究*

馬銀鵬，孔祥輝，韓增華，馬慶芳，戴肖東，劉佳寧，張介馳，張丕奇

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]富含蛋白質、粗纖維、維生素等營養物質，含有的多糖、黑色素、腺苷等活性物質具有抗氧化、降血脂、降血糖等功效，是一種珍貴的食（藥）用菌[2]。目前，黑木耳栽培以露地栽培模式為主[3]，環境的可控性較差，整個生長發育期間時常受到各種生物和非生物的脅迫[4]。在非生物脅迫中，溫度是對食用菌生長發育影響最活躍、最重要的因素[5]。

高溫是導致食用菌產量降低和品質下降的重要非生物脅迫因子之一，生物體對高溫脅迫的耐受性是其賴以生存和正常發育的重要特性[6]。真菌菌絲的培養特征與環境條件密切相關，層孔菌屬（Fomes sp.）菌株EUM1在40℃高溫脅迫時，菌絲體分支率、菌絲長度和菌絲直徑分別降低15%、32%和13%[7]。劉秀明等[8]研究了不同白靈側耳（Pleurotus eryngii var.tuoliensis）菌株對高溫脅迫的反應，結果發現4個白靈側耳菌株高溫脅迫后，恢復培養時菌落的生長速率、生長勢和菌絲形態特征存在差異。不同種類食用菌不僅菌落形態不同，而且菌絲的微觀形態也不完全相同[9]，在受到高溫脅迫后，菌絲的微觀形態對高溫脅迫的應激反應也不相同。開展高溫脅迫的生理研究時，需要穩定的試驗條件和參數，以優化高溫脅迫響應機制研究的試驗條件。張美敬等[10]研究了糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）和白黃側耳（P.cornucopiae）高溫脅迫的條件，結果發現2種側耳的高溫脅迫溫度為40℃，脅迫時間為48 h。目前對黑木耳高溫脅迫條件的研究報道較少，僅李紅等[11]比較了遼寧省主栽的9個黑木耳菌株的耐高溫能力，發現“黑29”和”純黑山”經42℃高溫脅迫8 h后可恢復正常生長。

因此，通過對不同黑木耳菌株最適生長溫度，高溫脅迫溫度和脅迫時間的測定，研究高溫脅迫后黑木耳菌絲恢復生長的情況，以期獲得黑木耳高溫脅迫生理研究的試驗條件和參數，以確定黑木耳高溫脅迫的最適條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

27株黑木耳菌株材料信息見表1，均保藏于黑龍江省科學院微生物研究所菌種保藏中心。

表1 供試材料Tab.1 Strains used in this study

1.1.2 培養基

PDA培養基，購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 最適生長溫度

將黑木耳菌種繼代培養后3次活化，使用菌齡7 d的菌種為材料，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑1 cm的菌塊，接種到PDA培養基中央（培養皿直徑90 mm），培養基定量25 mL，菌絲面朝上。分設25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃共6個溫度梯度，每個溫度梯度設5個重復。分別于各溫度條件下培養，菌絲生長量以菌落直徑計量，以長速最快的菌株長滿培養皿時終止培養，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 高溫脅迫處理條件

參考植物高溫脅迫處理溫度，即高溫脅迫處理溫度為最適溫度提高10℃[10]，分設為最適生長溫度提高10℃、提高12℃和提高14℃共3種高溫脅迫處理方式。以最適生長溫度培養7 d的各黑木耳菌株為試驗材料，高溫脅迫處理后于最適生長溫度下恢復生長，以高溫脅迫后菌絲恢復生長情況為指標，研究黑木耳菌株高溫脅迫處理的最適條件。

1.2.3 高溫脅迫后菌絲恢復生長情況

黑木耳菌株于最適生長溫度條件下培養7 d，最適高溫脅迫條件處理，最適生長溫度恢復培養，觀測計算菌絲恢復的生長速率。挑取恢復的黑木耳菌絲于顯微鏡下觀察恢復后菌絲尖端的顯微形態，測量菌絲尖端直徑。黑木耳菌株恢復生長10 d后，觀察菌絲色素產生情況。每個處理3個重復。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 16軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析方法進行顯著性分析，不同小寫字母表示差異達到顯著水平 （P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 菌絲最適生長溫度

不同溫度條件下黑木耳菌株菌絲平均生長速率見圖1。

圖1 不同溫度條件下黑木耳菌株菌絲平均生長速率Fig.1 Mycelial growth rate of Auricularia heimuer strains under different temperatures

由圖1可知，隨著培養溫度提高，黑木耳菌株菌絲平均生長速率呈先升高后降低趨勢，其中以30℃下黑木耳菌株菌絲平均生長速率最大，為（0.42±0.08）cm·d-1，25℃下黑木耳菌株菌絲平均生長速率最小，為 （0.36 ± 0.11）cm·d-1。

不同黑木耳菌株最適生長溫度不完全相同，其中14株（51.9%）黑木耳菌株在30℃下菌絲生長速率最大，8株（29.6%）黑木耳菌株在33℃下菌絲生長速率最大。38℃下黑木耳菌株菌絲均未萌發生長，可能是由于38℃下培養基失水太快，菌絲萌發困難。

不同溫度條件下各黑木耳菌株菌絲均潔白濃密，長勢較好，其中28℃和30℃下菌絲長勢最佳。隨著培養溫度的提高，黑木耳菌株氣生菌絲呈增加趨勢。

綜合以上試驗結果，選取黑木耳菌株的最適生長溫度為30℃。

2.2 高溫脅迫處理條件

高溫脅迫處理結果發現，40℃和42℃分別處理2 h、4 h和6 h，30℃時所有黑木耳菌株均可恢復生長。44℃處理2 h，30℃時所有黑木耳菌株均可恢復生長，但不同黑木耳菌株菌絲恢復生長速率不同。44℃處理4 h，30℃時8株（29.6%）黑木耳菌株恢復生長。44℃處理6 h，30℃時2株（7.4%）黑木耳菌株恢復生長，2株（7.4%）黑木耳菌株恢復生長較慢。隨著脅迫溫度的升高，培養基內水分損失較嚴重，影響黑木耳菌絲恢復生長。綜合考慮，黑木耳菌株菌絲最適高溫脅迫條件為44℃處理2 h。

2.3 高溫脅迫后菌絲恢復生長情況

黑木耳菌株最適高溫脅迫條件下菌絲恢復生長情況見表2。

表2 黑木耳菌株高溫脅迫后菌絲恢復生長情況Tab.2 Recovery of mycelical growth of Auricularia heimuer strains under heat stress

由表2可知，44℃高溫脅迫處理2 h，置于30℃培養4 d，所有黑木耳菌株菌絲均恢復生長，但是菌絲恢復生長速率不同，不同黑木耳菌株菌絲恢復生長速率差異顯著（P＜0.05）。農06（編號15）菌絲恢復生長速率，最大為 （0.40 ± 0.17）cm·d-1，黑蓮（編號 22）菌絲恢復生長速率，最慢為 （0.09±0.12）cm·d-1。

不同黑木耳菌株高溫脅迫處理后，菌絲恢復生長長勢、菌絲尖端變化、菌絲尖端直徑、色素產生情況不同。11株（40.7%）黑木耳菌株菌絲恢復后長勢較好，菌絲潔白、濃密，而其他黑木耳菌株菌絲恢復后長勢一般，菌絲較潔白、稀疏。15株（55.6%）黑木耳菌株高溫脅迫后在脅迫處形成凸起，凸起處氣生菌絲較多，恢復生長后新生長的菌絲與未高溫脅迫處理菌絲基本一致。各黑木耳菌株菌絲尖端直徑為 0.77 μm～1.15 μm，其中特產 2 號菌絲尖端直徑最大為 （1.15± 0.01）μm；興安 4 號菌絲尖端直徑最小為 （0.77±0.03）μm。11 株 （40.7%）黑木耳菌株高溫脅迫后產生色素，其他黑木耳菌株高溫脅迫后產生少量色素或不產生色素。

3 討論與結論

生物體對環境脅迫的應答一直是生物學的基本問題。環境條件（溫度、濕度、pH、滲透壓、氧分壓等）的改變均會對生物體造成壓力或脅迫。溫度是影響生物體生理過程的重要生態因子之一，而食用菌在生長發育過程中，遇到高溫脅迫時，會造成菌絲生長停滯、污染甚至死亡。決超[12]研究發現高溫對糙皮側耳生長發育4個典型階段的生理生化特征造成影響，如對菌絲丙二醛（MDA）含量、可溶性物質變化、胞外酶、抗氧化酶活性和酯酶同工酶有影響。仇志恒[13]研究發現高溫脅迫后的糙皮側耳菌絲抵御棘孢木霉（Trichoderma asperellum）侵染的能力下降。因此，高溫影響食用菌的生理過程，已成為限制食用菌生產的主要環境因子。不同種類食用菌對高溫脅迫響應不同，最適高溫脅迫處理條件存在差異。張美敬等[10]優化了糙皮側耳和白黃側耳高溫脅迫條件，脅迫研究條件為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養菌絲3 d，最適高溫脅迫溫度為40℃（最適溫度加12℃），高溫脅迫處理48 h。

本研究發現黑木耳菌絲最適脅迫溫度為44℃處理2 h；黑木耳高溫脅迫溫度為最適合溫度加14℃，可能是由于黑木耳菌絲對高溫的耐受性較強，與李紅等[11]的研究結果相似，44℃高溫脅迫處理6 h后仍有4株黑木耳菌株能恢復生長。說明黑木耳菌絲較能耐高溫，但對高溫脅迫時間耐受性較差，可能是由于長時間的高溫脅迫導致培養基失水過多，黑木耳菌絲無法繼續生長。

高溫脅迫下，氧化應激增強會引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）氧化生物膜，而形成脂質過氧化產物等[14]。硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances， TBARS）包 含 了大部分氧化傷害產生的醛酮類物質，因此作為衡量脂質過氧化的重要生理指標[15]。另外，高溫脅迫下菌絲保護酶活性的變化也可作為一種評價指標。郭敬等[16]研究發現高溫脅迫對白玉菇（Hypsizygus marmoreus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、真姬菇（Hypsizygus marmoreus）菌絲胞內酶和菌絲保護酶均有不同程度影響。此次研究僅通過高溫脅迫后菌絲恢復生長情況初步確定了黑木耳最適高溫脅迫條件，結果有待通過菌絲保護酶活性等方面的研究進一步優化。