TNF-α、NF-κB蛋白表達在稽留流產患者絨毛組織中的變化及其意義分析

陳湘玲 董明慧 畢穎 王維香

胚胎或胎兒已經死亡且滯留在宮腔內未能及時自然排出的情況在臨床上稱之為稽留流產(missed abortion，MA)。近些年相關研究[1]認為稽留流產的發病率呈上升趨勢，也因此引起臨床上的重視。稽留流產病因研究[2]發現，胚胎因素、免疫系統因素、感染等生理因素以及環境、社會等外界因素均可引起稽留流產的發生。有研究[3-4]顯示，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和核轉錄因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在流產的發生過程中其表達水平顯著升高，與流產密切相關。因此，本研究在既往研究基礎上比較稽留流產患者與正常對照組流產后絨毛組織中TNF-α、NF-κB表達情況，并探討其在稽留流產發生中的意義。現報告如下。

對象與方法

1.研究對象：將2016年1月至2017年1月本院收治的30例早期稽留流產患者作為稽留流產組，同期在本院正常妊娠早期婦女30例為正常對照組，兩組患者自愿要求終止妊娠。患者年齡為27～31歲，平均年齡(27.9±2.2)歲，平均停經時間(62±6)d；兩組患者的一般臨床資料無統計學差異，具有可比性。

2.病例納入排除標準：根據稽留流產診斷標準[3-4]確診稽留流產者。所有研究對象要求既往月經規律，未放置宮內節育器，無生殖道發育異常、明顯感染及重要臟器疾病史，近3個月內未使用過激素類藥物、無外傷及毒物放射線接觸史。對照組既往無流產、死胎、死產等不良孕產史，無遺傳史。所有入選研究對象對本研究知情同意。

3.標本采集：負壓吸引術吸出孕囊后，立即分離出絨毛組織，無菌生理鹽水沖洗干凈，即刻分裝于經焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的2 mL凍存管中，15 min內置于-80 ℃ 超低溫冰箱中保存。

4. 實驗流程：將獲得的絨毛組織使用10%福爾馬林溶液充分固定，待靜置固定24 h后，對絨毛組織進行脫水、透明處理、浸蠟、包埋等操作，處理所得的組織再制備為蠟塊，為下一步免疫組化實驗提供準備。

(1)免疫組化實驗。經包埋后的組織標本4 μm連續切片6張，參照說明書進行免疫組化實驗。各組絨毛組織切片樣本在經二甲苯脫蠟后經以下步驟完成染色。①無水乙醇、梯度酒精中依次浸泡5 min，重復2次；②在溫度37℃條件下，使用3% H2O2、10 min；③在溫度37 ℃條件下，抗原修復液處理10 min；④孵一抗，過夜；⑤在溫度37 ℃條件下孵育二抗，共20 min；⑥滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液處理20 min；⑦顯色劑混合溶液(6 min)，蘇木素(1 min)，流水沖洗至無染色劑；⑧1%鹽酸酒精分化、1%胺水藍化后流水沖洗，逐步；⑨脫水、透明、封片、觀察。在染色過程中，步驟①、⑦、⑧完成后應使用流水沖至切片無溶液殘留，其余各步驟完成后均使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗5分鐘，重復3次；操作步驟⑨時，應注意逐步脫水。

(2)結果判定標準。參照相關文獻[5-6]進行實驗結果判定：依據細胞漿、細胞核[7]內含黃/棕黃色顆粒者均屬于TNF-α表達、NF-κB陽性表達，并通過切片組織染色分值確定陽性強度。

切片組織染紫色，通過OLYMPUS光學顯微鏡觀察細胞染色強度及染色范圍，以染色分值進行評價(半定量法)。切片染色強度分為0～3分，分別對應基本不著色、著色較淡、著色相對適中、著色較深。隨機選取5個高倍視野，根據其陽性細胞所占視野內細胞的比例計算染色范圍，分為0～3分，分別對應的陽性細胞比例為<5%、5%～20%、21%～50%、>50%。細胞的染色范圍和染色強度所得分數總和為0～6分，陰性(-)為≤2分，弱陽性(+)為3分，陽性(++)為4～5分，強陽性(+++)為6分，>2分者均定義為陽性。

已知乳腺癌切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

5. 統計學處理：采用SPSS19.0軟件進行統計分析，計量數據用均數±標準差表示，正態分布及方差齊，兩組比較采用t檢驗；計數資料以率表示，兩組比較采用卡方檢驗。P<0.05為有統計學意義。

結果

1.兩組TNF-α在絨毛組織中的表達分析：稽留流產組絨毛組織的TNF-α的表達陽性率為93.3%，而正常對照組僅為10%，兩組相比，稽留流產組顯著高于正常對照組(P<0.05)。稽留流產組的平均染色分值為(3.2±1.7)，正常對照組的平均染色分值為(1.6±1.0)，兩組間差異有統計學意義；見表1。

2. 兩組NF-κB在絨毛組織中的表達分析：稽留流產組絨毛組織的NF-κB的表達陽性率為90.0%，而正常對照組僅為16.7%，兩組相比，稽留流產組顯著高于正常對照組(P<0.05)。稽留流產組的平均染色分值為(3.7±1.7)，正常對照組的平均染色分值為(2.2±1.1)，兩組間差異有顯著統計學意義；見表2。

討論

已知MA在一定程度上會導致胎盤組織機化、凝血功能障礙、彌漫性血管內凝血等并發癥，甚至會危及患者生命。有研究[8]認為，MA的發生與患者免疫功能密切相關；也有研究[9]顯示，感染是影響稽留流產發生的主要病因之一，兩者具有較高的相關性。無論是免疫異常或是感染均與炎癥密切相關，TNF-α和NF-κB是常見的與炎癥相關的細胞因子。TNF-α是由巨噬細胞產生并在生物組織中廣泛表達，是一種具有多種生物學活性的細胞因子。研究[10]證實，一定水平的TNF-α可對妊娠期機體產生有利的促胚胎發育作用，同時可以改善孕體能量代謝、維持妊娠，主要因為TNF-α可促進機體內合成更多的孕激素及絨毛組織促性腺激素，其在刺激細胞滋養層生成尿激酶型纖溶酶原激活劑的同時，有利子宮蛻膜組織外基質降解及胎盤植入[11]。而NF-κB是一種核轉錄因子，主要參與調控機體免疫、炎癥、細胞增殖分化及凋亡等相關基因的轉錄，尤其是免疫與炎癥反應。研究[12]顯示，妊娠的成功與特異性的下調NF-κB的表達密切相關，NF-κB表達下調可增強妊娠期的免疫抑制，有利于妊娠的順利進行。而本研究正常對照組TNF-α表達陽性率為10.0%、TNF-α平均染色分值為(1.9±1.0)。而正常對照組的NF-κB的表達陽性率16.7%、平均染色分值(2.2±1.1)，顯示對照組機體TNF-α、NF-κB水平的符合機體內代謝需要及水平情況，與張翔等[13]結果相近。

表1 兩組TNF-α在絨毛組織中的表達

表2 兩組NF-κB在絨毛組織中的表達

只有機體免疫功能紊亂、巨噬細胞激活的情況下，才會致使腫瘤壞死因子水平上升。當TNF-α水平過高時，會誘導滋養細胞的凋亡，細胞表面絨毛組織的減少，導致組織水腫、細胞受損。研究發現，在反復自然流產患者的血清及蛻膜組織中，TNF-α的水平均明顯升高。而在早期流產的動物研究中也發現，大鼠子宮中的NF-κB的表達顯著高于正常妊娠及非妊娠大鼠。因此，MA作為一種特殊的流產類型，患者的TNF-α和NF-κB也可能有升高的趨勢，本研究通過對比觀察稽留流產早期妊娠婦女與正常早期妊娠婦女流產后絨毛組織中TNF-α和NF-κB表達的情況，以分析TNF-α和NF-Κb在稽留流產的作用機制。

研究結果顯示，稽留流產組絨毛組織的TNF-α表達陽性率為93.3%、平均染色分值為(3.2±1.7)，均顯著高于正常對照組。而在NF-κB的表達方面，稽留流產組的表達陽性率為90.0%、平均染色分值為(3.7±1.7)，均顯著高于正常對照組，這表明在稽留流產患者中確實存在TNF-α和NF-κB表達增高的情況[14]，這是因為正常妊娠者體內一定的TNF-α、NF-κB水平符合機體代謝的需要，觀察組TNF-α表達升高，結合患者的病史、孕產史、近期內無外源性致病史，說明其體內存在機體免疫功能紊亂或巨噬細胞激活，觀察組TNF-α、NF-κB水平異常，說明其與稽留流產有一定的關系；其免疫功能異常或巨噬細胞激活，孕激素、絨毛組織促性腺激素生成受影響，細胞滋養層對尿激酶型纖溶酶原激活劑的生成功能與正常對照組有異常，影響胚胎或是胎兒的宮內發育；在胚胎或胎兒已經死亡發生時[15]，雖然不能及時確診，但其滯留在宮腔內，子宮蛻膜組織外基質不能降解，機體內免疫系統對死亡組織的吸收反應導致TNF-α、NF-κB水平進一步紊亂。以上綜合說明稽留流產的發生與母體的免疫功能異常或感染引起的炎癥相關。

綜上所述，稽留流產患者絨毛組織中TNF-α和NF-κB的表達陽性率顯著提高，這可能與稽留流產的發生與母體的免疫功能異常或感染引起的炎癥相關。