miR-499 rs3746444多態(tài)性抑制宮頸癌細胞的增殖作用及分子機制

蘇俊玲 烏云 楊文靜 張燕

宮頸癌是一種宮頸上皮細胞高度分化的惡性腫瘤，位列全球女性常見癌癥第四位[1]。根據(jù)國際癌癥研究機構(the International Agency for Research on Cancer，IARC)的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球?qū)m頸癌患者高達近52.7萬人，其中2018年有近31.1萬人死于此病，嚴重威脅著女性健康[1-2]。雖然包括手術治療、放化療在內(nèi)的多種治療方式對宮頸癌都有不錯的治療效果，然而其患者生存率依然極低[3-5]。因此，深入解析宮頸癌發(fā)生發(fā)展分子機制有助于探究新的有效可行的治療策略。

臨床數(shù)據(jù)顯示，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)DNA檢測為陽性被認為是宮頸癌發(fā)病的高危因素[6]。然而，健康婦女中亦有HPV陽性表達，但是僅有少部分發(fā)展為宮頸癌[7]。因此，HPV并非為宮頸癌的唯一誘因。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，基因遺傳的多態(tài)性也參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，然而機制不詳[8]。微小RNA(micro RNAs，miRNAs)是一種長約18～25個核苷酸的高度保守的非編碼RNA，其與信使RNA結(jié)合而調(diào)節(jié)基因的表達。miRNAs調(diào)節(jié)機體的多個生理和病理學過程，包括癌癥細胞的增殖分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。有研究報道，miR-499通過與PTEN、p21和MMP7結(jié)合，促進口咽癌增殖、遷移和侵襲[11-12]，提示miR-499可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

最新研究證實，microRNA的遺傳變異與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關[13]。成熟miR-499基因rs37346444位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與宮頸癌和肺癌等多種癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關[13-14]。miR-499 A/G具有抑制凋亡作用[15]。調(diào)控靶點包括轉(zhuǎn)錄因子Sox4、Sox6和CD200等[16]，其中Sox6參與調(diào)控機體的多個生物學過程，包括紅血球母細胞的增殖，中間神經(jīng)節(jié)向皮質(zhì)中心神經(jīng)元的正常定位和成熟等[16]。此外，Sox6參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌、體外抑制白血病細胞增殖[17]。由此可見，Sox6與癌癥發(fā)病機制關系密切。然而，并未見Sox6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中相關報道。因此，本研究體外探討miR-499 rs3746444位點多態(tài)性是否通過Sox6影響宮頸癌細胞增殖生長，為宮頸癌的診斷提供更好的生物標記和發(fā)病機制說明。

資料與方法

一、臨床資料與樣本采集

招募自2012年6月至2018年12月于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院就診的857例宮頸癌患者作為實驗組(宮頸癌組)，年齡23～62歲。病理類型包括腺癌 (epitheloid cervical carcinoma, SCC) 523例、鱗癌234例和腺鱗癌98例；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 (International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO) 之宮頸癌分期標準進行分期，其中Ⅰ期34例、Ⅱ期238例、Ⅲ期363例、Ⅳ期222例。分化程度包括高分化34例、中分化238例和低分化560例。873例同期健康志愿者作為對照組，年齡23～62歲。所選研究對象均由專業(yè)醫(yī)師經(jīng)盲法病理診斷證實，術前均未進行任何干預治療。根據(jù)臨床病歷獲得包括年齡、癌癥分期、腫瘤尺寸、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病例特征信息、HPV檢測結(jié)果及實驗組腫瘤大小及相關病理學檢查結(jié)果。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準，所有研究對象均了解研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

二、方法

1.主要試劑與儀器：實驗期間收集各組人群外周血并分離血漿，宮頸癌患者收集腫瘤病變組織和癌旁組織共同凍存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ藢m頸上皮永生化細胞H8和人宮頸癌細胞系，即腺癌樣SiHa、上皮樣HeLa和C33A細胞購自中國科學院上海細胞庫，外周血全基因組DNA提取純化試劑盒與基因分型PCR Mix購自武漢擎科生物科技有限公司，miR-499 rs3746444位點TaqMan探針引物購自上海生工生物科技有限公司，pcDNA3.1-Sox6 (cDNA全長序列)質(zhì)粒購自北京奧科生物科技有限公司，Lipo2000、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司，胎牛血清購自美國Ausgene公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所，RIPA裂解液、Cocktail、磷酸化酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯影液和HRP-小鼠抗兔二抗購自武漢塞維爾生物技術有限公司，兔抗人Sox6、b-actin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4和CDK6抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

2. 血液基因組提取和miR-499 rs3746444位點基因分型：抽取受試者5 mL外周血，依據(jù)外周血全基因組DNA提取純化試劑盒，提取DNA后檢測OD260/OD280比例，并凍存于-80℃。取10 ng作為反應模板，按照TaqMan探針法對rs3746444位點的多態(tài)性進行基因分型。引物序列為上游5′‐CAAAGTCTT CACTTCCCTGCCA‐3′、下游5′‐GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC‐3′。根據(jù)說明書采用10 ul體系進行PCR反應，完畢后在ABI 7900HT儀器上讀板，獲得分型結(jié)果。

3. 構建基于熒光素酶的報告質(zhì)粒：設計Sox6 3′UTR全長成對PCR擴增引物、Sox6引物上游5′-GACATTTCGCTCCCTTTCCC-3′、下游5′-ACTGTGGCAGCCTTGCTCAT -3′，將PCR產(chǎn)生亞克隆到pGL3-無啟動子熒光素酶的質(zhì)粒中。設計針對人基因組DNA的PCR擴增引物，引物序列為上游5′- AGGTGAGGTCCAGACTGGGG - 3′、下游 5′- TGGTTAGGGACCAGAGGGGA -3′，基于PCR的點突變構建含有miR-499的GG和AA基因型的pSilence 2.1-U6質(zhì)粒。

4. 雙熒光素酶報告基因測定: 接種于12孔板的Hela和SiHa細胞，24 h采用3 mL 的Lipo2000轉(zhuǎn)染pGL3- Sox6 3′UTR和miR-499的GG或AA的pSilence 2.1-U6質(zhì)粒48 h后，收集細胞并用Fluoroskan酶標儀測量每組的熒光素酶活性，每組復孔3個，獨立重復3次。

5. 細胞增殖實驗: 使用試劑盒-8測定細胞活力。將細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔板中; 在24 h后，加入CCK-8溶液(每孔含10 μl，含有100 μl培養(yǎng)基)。將板在37℃下孵育4 h，然后測量450 nm處的吸光度。所有實驗復孔3個，重復3次。

6. Western blot 實驗: 用含有PMSF的RIPA裂解緩沖液裂解提取處理的Hela和SiHa總蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度。30 μg通過在8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA封閉30 min后，4℃一抗孵育12 h。兔多克隆抗Sox6抗體(1∶800)，抗CyclinD1抗體(1∶800)和抗CyclinE抗體(1∶800)，抗CDK4抗體(1∶1 000)和抗CDK6抗體(1∶1 000),以抗b-actin抗體(1∶2 000)作為上樣對照。HHRP-小鼠抗兔二抗IgG二抗(1∶5 000)孵育1 h，并使用ECL顯影液顯色，以Image J分析灰度變化。

結(jié) 果

一、研究對象臨床病理資料分析

結(jié)果如表1所示。宮頸癌組和對照組的年齡分布無明顯差異。宮頸癌組HPV16陽性率為97.5%，HPV18陽性率為96.0%，明顯高于對照組(HPV16為0.2%；HPV18為0.1%)，符合臨床診斷標準。

表1 宮頸癌病人臨床病理參數(shù)特點[例(%)]Table 1 Characteristics of clinicopathological parameters of patients with cervical cancer [n(%)]

二、miR-499基因位點rs3746444基因型頻率分布

miR-499基因rs3746444位點基因型頻率分布結(jié)果如表2所示。Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗miR-499基因rs3746444位點的基因型及等位基因頻率在健康志愿者中的分布均符合遺傳平衡，通過校正年齡的混雜因素影響后，AG和GG基因型宮頸癌發(fā)生風險分別是AA基因型個體的1.1倍和2.4倍，攜帶G等位基因的個體患宮頸癌的風險是AA基因型個體的1.3倍，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表2 宮頸癌患者和健康志愿者miR-499基因rs3746444位點基因型頻率分布Table 2 The genotype frequency distribution of miR-499 gene rs3746444 in cervical cancer patients and healthy volunteers, n(%)

三、 rs3746444基因型在宮頸癌患者臨床特征中的分層分析

宮頸癌患者中，GG基因型在55歲及以上婦女中比例最低(9.0%)，與AA基因型(71.1%)相比，差異具有統(tǒng)計學意義。GG基因型個體HPV16和HPV18型陽性率均比AA基因型高，差異具有統(tǒng)計學意義。從腫瘤尺寸來看，GG基因型宮頸癌患者腫瘤與AA基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義。AA基因型中I、II、III和IV型癌癥分期比例與GG基因型的癌癥分布差異具有統(tǒng)計學意義，GG基因型宮頸癌患者II期和IV的比例顯著高于AA基因型。其次，從腫瘤分化程度來看，AA基因型患者腫瘤分化程度與GG基因型患者相比，兩種基因型在腫瘤分化程度上的分布差異具有統(tǒng)計學意義。見表3。

四、miR-499 rs3746444基因型調(diào)節(jié)宮頸癌相關細胞體外增殖能力情況

為了研究miR-499 rs3746444對Sox6蛋白表達與細胞增殖作用影響，通過構建突變質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細胞檢測細胞活力。rs3746444不同基因型對正常宮頸H8細胞的增殖無顯著影響(圖1)。miR-499 GG+Sox6-3′UTR處理組Hela、C33A和SiHa細胞72 h時OD450顯著低于miR-499 AA+Sox6-3′UTR組，且高于Sox6-3′UTR組(P均<0.05)。

表3 miR-499基因位點rs3746444基因型在宮頸癌患者臨床特征中的分層分析[例(%)]Table 3 Stratified analysis of miR-499 locus rs3746444 genotype in the clinical characteristics of cervical cancer patients, n(%)

五、miR-499 A/G對人宮頸癌Hela和SiHa細胞周期相關蛋白表達的影響

如圖2所示，miR-499 GG+Sox6-3′UTR處理組Hela和SiHa細胞Cyclin D1、CyclinE、CDK4和CDK6顯著高于miR-499 AA+Sox6-3′UTR組，低于Sox6-3′UTR組(P<0.05)。

圖1 miR-499 A/G對不同宮頸癌細胞系增殖能力的影響Figure 1 Effects of miR-499 A/G on the proliferation of different cervical cancer cell lines

圖2 miR-499 A/G對宮頸癌Hela和SiHa細胞周期相關蛋白的影響Figure 2 The effect of miR-499 A/G on cell cycle-related proteins of cervical cancer Hela and SiHa

六、miR-499 A/G對人宮頸癌Hela和SiHa細胞Sox6蛋白表達水平的影響

如圖3所示，與miR-499 AA+Sox6-3′UTR處理組相比，miR-499 GG+Sox6-3′UTR處理組Sox6的表達水平增加(P<0.05)。且均低于Sox6-3′UTR對照組(P<0.05)。

七、miR-499 A/G對人宮頸癌Hela細胞Sox6轉(zhuǎn)錄活性的影響

如圖4所示，與Control組相比，miR-499 AA處理組的Sox6 3′UTR WT的frey和Renilla熒光素酶活性顯著降低，miR-499 GG處理組的Sox6 3′UTR WT的frey和Renilla熒光素酶活性沒有明顯的變化，miR-499 AA處理組frey和Renilla熒光素酶活性顯著低于miR-499 GG處理組(P<0.05)。Control，miR-499 AA，miR-499 GG處理組的Sox6 3′UTR 突變的frey和Renilla熒光素酶活性之間沒有明顯的變化。

圖3 miR-499 A/G對人宮頸癌細胞系Hela和SiHa細胞SOX6蛋白表達水平的影響Figure 3 The effect of miR-499 A/G on the expression of Sox6 protein in human cervical cancer cell lines Hela and SiHa

圖4 過表達miR-499 GG基因型抑制Sox6野生型熒光素酶活性Figure 4 Overexpression of miR-499 GG genotype inhibits Sox6 wild-type luciferase activity

討 論

宮頸癌是當今威脅女性健康的重大癌癥之一，臨床研究證實早期診斷和治療干預能夠及時有效治療宮頸癌[3]。除了尋找新的宮頸癌診斷標志物外，進一步了解宮頸癌發(fā)生的病理分子機制對于開發(fā)更有針對性和有效的治療方法是至關重要的[8]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)機體miRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生具有強烈的關聯(lián)性，這些miRNA可以作為癌癥的預測和預后的分子標記[18-20]。

早期研究證實，miR-499等遺傳變異對宮頸癌的惡化密切相關，其rs3746444突變(A>G)具有明顯患宮頸癌的可能[20]。在本研究中對選取的宮頸癌患者標本進行基因分型分析發(fā)現(xiàn)，miR-499 GG的宮頸癌患者比AA患者的發(fā)生風險明顯升高。并且GG表型比AA表型的宮頸癌患者都表現(xiàn)為高度分化，這與以往的研究報道一致[21]，揭示GG表型具有抑制凋亡的作用及對宮頸癌惡化的重要性。前期對心肌細胞分化研究證實，miR-499可與轉(zhuǎn)錄因子Sox6和Cyclin D1作用調(diào)控細胞增殖和凋亡[15-16]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，miR-499可結(jié)合Sox6的3′-UTR影響其轉(zhuǎn)錄，其GG突變上調(diào)Sox6蛋白介導的細胞周期蛋白表達，促進細胞增殖生長。

綜上所述，宮頸癌miR-499的rs3746444突變(A>G)對宮頸癌細胞生長具有明顯的促進作用，且與其Sox6介導的細胞周期蛋白CyclinD1上調(diào)密切相關。本研究結(jié)果為miR-499的rs3746444突變(A>G)用于宮頸癌的診斷和治療提供了實驗依據(jù)。同時揭示其突變可作為宮頸癌的危險因子，對臨床宮頸癌診斷和治療意義重大。