羥基脲誘導神經管畸形小鼠模型及與其他小鼠模型的比較研究

官臻 王秀偉 朱智強 岳慧軒 李莘 秦佳星 牛勃 王建華

神經管畸形(neural tube defects, NTDs)是在胚胎發育過程中，表現出以神經管未閉引起的頭部、脊柱部位畸形的出生缺陷疾病，包括無腦兒、腦膨出、脊柱裂[1]。由于NTDs是多病因、多層次復雜疾病，其作用機制尚不十分明確，目前研究發現，圍孕期增補服用葉酸對胚胎發育早期有重要作用，可以有效降低NTDs的發生[2]，但其具體機制還需要進一步闡明。由于體內強大的代償機制，葉酸缺乏引起的NTDs的動物模型迄今尚未有建成的報道。

葉酸是一種水溶性B族維生素，不能被人體合成，需要通過飲食得到。進入體內被二氫葉酸還原酶(DHFR)形成有活性的四氫葉酸(THF)，作為一碳單位的載體參與一碳單位的轉運，四氫葉酸多聚谷氨酸接受和傳遞一碳單位介導細胞生物過程。胞漿中的葉酸介導一碳代謝有三個相互依賴的代謝過程，包括核苷酸的合成、胸苷酸的合成以及甲硫氨酸循環[3]。嘌呤合成N10-甲酰基四氫葉酸上的甲?；峁┝肃堰虱h上的C-2的甲基。由胸苷酸合酶(TS)催化N5,10-亞甲基四氫葉酸攜帶一碳單位轉移到脫氧鳥苷一磷酸(dUMP)上，形成脫氧胸苷一磷酸(dTMP)和二氫葉酸(DHF)，DHF被還原成THF再次利用。本課題組前期依據葉酸代謝原理，選擇抑制葉酸代謝通路中關鍵酶(二氫葉酸還原酶和胸苷酸合酶)靶點，誘導構建了NTDs小鼠模型。除dTMP是從dUMP轉變而來，其他脫氧核苷酸是在二磷酸核糖水平上進行，由核苷酸還原酶催化形成的。核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase，RR)負責將核糖核苷酸轉化為脫氧核糖核苷酸，從而為DNA合成、修復生物過程提供所需的前體。羥基脲 (hydroxyurea，HU) 是迄今為止唯一用于臨床的核糖核苷酸還原酶 (ribonucleotide reductase，RR) 抑制劑，主要機制是將自身的一個電子轉移到RR小亞基酪氨酰自由基使其還原滅活，并可還原鐵中心使其丟失結合的鐵離子而抑制RR活性。HU將會阻斷DNA合成的原料，直接影響DNA的合成[4-5]。利用神經嵴細胞增殖分化遷移形成神經管的關鍵時期，通過使用核苷酸還原酶的靶點抑制劑HU，觀察NTDs小鼠模型中細胞增殖凋亡失衡對神經管發育的影響，并且與之前構建的葉酸代謝障礙的NTDs小鼠模型比較，為進一步研究NTDs的機制提供了新的動物模型。

材料與方法

一、材料與試劑

1. 實驗動物：選用C57BL/6J小鼠，購買于北京華阜康公司，要求小鼠的年齡在7～8周，小鼠的體重在18～20 g，購買雌鼠60只和雄鼠30只，常規飼養于SPF級動物房，該研究由本單位的實驗動物倫理委員會所批準(批準號：KSDWLL2017019)。

2. 試劑和儀器：注射用羥基脲 (HU；Sigma公司，美國)；一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒，Bradford法蛋白質定量檢測試劑盒，Western Blot試劑盒(購買于生工生物工程公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Cleaved Caspase-3抗體(CST，美國)，PCNA 抗體(CST，美國)，半胱天冬蛋白酶-3 (Caspase-3)抗體(CST，美國)，β-actin 抗體(CST，美國)；體式顯微鏡(OLYMPUS，SZ2-ILST、奧林巴斯有限公司)。

二、方法

1. 動物模型的誘導建立、標本采集及胚胎神經組織的病理切片：小鼠飼養一周后，選擇晚上18∶00按照雄雌(1∶2)進行合籠，早上進行分籠，用鑷子檢查雌鼠的陰道，將有陰栓的挑選出來，并且標記為孕0.5 d(E 0.5)。按照隨機分組的方法分為6組，實驗組分為5組，在神經管閉合前的孕7.5 d(E 7.5)，分別給予5種劑量的HU進行腹腔注射(即25 mg/kg、125 mg/kg、225 mg/kg、325 mg/kg、525 mg/kg，見表1)；而正常對照，使用0.9%的氯化鈉水溶液注射。斷頸法處死，取出胚胎，然后剝離掉胎膜，觀察胎鼠的情況、正常胚胎的數量、吸收胎的數量和畸形的數量，再次用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗胎鼠，置于體視顯微鏡下觀察畸形的具體情況。取材后用4%多聚甲醛固定，隨后進行脫水，石蠟包埋，切片(厚度為5 μm)。標本以蘇木精-伊紅染色(HE 染色)。

動物模型誘導構建后，與前期本課題組建立的葉酸代謝中的關鍵酶-二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)抑制劑MTX(4.5 mg/kg)、胸苷酸合酶(thymidylate synthase, TS)抑制劑RTX(11.5 mg/kg)、5FU(12.5 mg/kg)誘導構建的不同模型的結果進行比較。

2. 檢測神經上皮細胞的增殖和凋亡情況：采用免疫組化檢測胚胎13.5 d端腦的神經上皮細胞的增殖情況，胎腦的石蠟切片脫蠟，脫水、抗原修復，增殖細胞核抗原 (PCNA) 的一抗濃度(1∶4 000)，Caspase-3 一抗濃度(1∶1 000)，其他步驟按照說明書進行，最后在顯微鏡下拍照統計分析。

3. Western blot檢測正常對照組和NTDs組中PCNA蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平：利用PCNA抗體和Cleaved Caspase-3抗體對組織蛋白裂解液進檢測，觀察PCNA和Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平在正常對照組和NTDs組中是否存在差異。收集胚胎13.5 d正常對照組和NTDs組的胎腦的神經組織，加入裂解液，置于冰上操作，提取組織中的總蛋白。采用Bradford法蛋白質定量檢測蛋白，一抗PCNA(稀釋比例1∶1 000)Cleaved Caspase-3(稀釋比例1∶800)，加入二抗(抗兔，稀釋比例1∶2 000)，采用Image J圖像分析軟件，以為β-actin內參，計算蛋白的相對表達水平。

4. 統計學處理：應用SPSS 23.0統計軟件進行分析，本研究涉及到的數據為計量資料，兩組均值的比較采用t檢驗，多組數據均值的比較采用方差分析，P< 0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、HU誘導神經管畸形小鼠的建立

在胚胎13.5 d(E 13.5)與正常對照組比較，隨著HU劑量的增加，吸收胎的比率呈現逐漸增加，從4.7%增加到94.1%。伴隨著HU劑量的增加，NTDs的發生率也在增加，在HU誘導225 mg/kg發生率最高，達到了最大畸形率(表1)。因此，225 mg/kg是誘導NTDs小鼠模型的最佳劑量。

二、HU誘導的NTDs小鼠胚胎體視鏡結果和病理改變

選取最適劑量HU(225 mg/kg)誘導的13.5 d的胎鼠，對其進行觀察，發現NTDs胎鼠與正常胎鼠外觀比較，神經管發育閉合不全，主要呈現腦膨出的畸形表型。HE染色結果顯示，HU誘導的NTDs胎鼠，其后腦未融合，組織結構紊亂，被一層間質和羊膜包裹，管腔不規則，界膜界限不清，室管膜邊緣紊亂。正常胎鼠的神經管閉合完整，腔面發育良好，界膜平整，室管膜邊緣整齊(如圖1)。

三、HU誘導的NTDs小鼠模型與其他葉酸代謝通路障礙的NTDs小鼠模型的比較

本研究將HU誘導的NTDs小鼠模型，與前期本課題組建立的葉酸代謝中的關鍵酶-二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)、胸苷酸合酶(thymidylate synthase, TS)抑制劑-MTX(methotrexate)、RTX(raltitrexed)、5FU(fluorouracil)均通過腹腔注射誘導的模型，進行比較[6-8]。發現干擾葉酸代謝均可誘導NTDs表明，在誘導劑最適劑量下，NTDs發生率均在31.4%～42.3%之間。其中畸形率比較高的是5FU組，誘導出的畸形率在42.3%，隨后是RTX，HU，MTX(表2)。其中NTDs大多數為露腦畸形。

四、HU誘導的小鼠模型的細胞增殖凋亡及與其他模型的比較

細胞增殖和凋亡貫穿于神經管發育的整個過程，Caspase-3是凋亡過程中重要的酶，可以代表細胞凋亡的情況；PCNA可以很好的反映細胞中DNA合成，是細胞增殖的特異性標記物。本研究選用HU最佳誘導劑量(225 mg/kg)誘導構建小鼠模型，對E13.5胎鼠端腦的神經上皮細胞進行了免疫組化的檢測，在室管膜層和中間層中看到正常對照組的PCNA的陽性細胞高于畸形胚胎組(P<0.05，圖2)。同時對Caspase-3進行了免疫組化的檢測，在室管膜層和中間層中看到NTDs組Caspase-3的陽性細胞高于正常組(P<0.05，圖3)。

表1 不同劑量HU對小鼠胚胎的影響Table 1 The effects of different doses of HU on mouse embryos

表2 不同藥物誘導對小鼠胚胎的影響Table 2 The effects of different drugtreatment on mouse embryos

本研究利用Western blot檢測HU(225 mg/kg)誘導的13.5 d的正常對照組的胎鼠和露腦畸形胎鼠神經組織的PCNA蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白情況，并與課題組前期的3組不同誘導方式構建的NTDs小鼠模型進行比較[6-8](見表3)。結果發現，PCNA蛋白在NTDs組中的表達水平低于正常對照組，并且差異有統計學意義(P<0.05，圖4)，和前期5FU誘導構建的NTDs小鼠模型相比較[7]，均發現和增殖相關的PCNA蛋白在NTDs組明顯低于正常對照組。

通過Western blot進一步驗證凋亡的情況，與課題組前期誘導的3組不同的小鼠模型進行比較[6-8](見表3)，均發現Cleaved Caspase-3蛋白在NTDs組中的表達水平明顯高于正常對照組，并且差異有統計學意義(P<0.05)，其中HU組中略高于其他組(圖5)。

表3 不同小鼠NTD模型中PCNA和Cleaved Caspase-3蛋白相對表達水平Table 3 Expressions of PCNA and Cleaved Caspase-3 in embryonic neural tissuesfor different NTDs murine model.

A:Expressions of PCNA in embryonic neural tissues of NTDs murine model induced by HU and 5FU. B:Fold changes of protein level. 圖4 不同葉酸代謝通路中的PCNA蛋白的表達情況Figure 4 Expression of PCNA proteins in different folic acid metabolic pathways

A:Expressions of Cleaved Caspase-3 in embryonic neural tissues of NTDs murine model induced by HU, MTX 5FU and RTX. B:Fold changes of protein level. 圖5 不同葉酸代謝通路中的Cleaved Caspase-3的表達情況Figure 5 Expression of Caspase-3 proteins in different folic acid metabolic pathways

討 論

葉酸缺乏與NTDs密切相關，其分子機制是目前神經管發育中的研究熱點。眾所周知，葉酸缺乏引起葉酸及一碳單位代謝異常，后者是核酸合成與修復、甲基化等生物體重要生命活動不可缺少的原料。但葉酸缺乏通過哪個重要環節引起胚胎神經系統發育異常，即葉酸缺乏引起NTDs的核心機制是什么，目前尚無定論。單純通過飲食缺乏葉酸構建的小鼠模型，大多數的表型為吸收胎和發育遲緩[9]，因此需要制備出有NTDs表型的動物模型，來揭示葉酸缺乏引起NTDs的機制。

本課題組前期誘導出3種葉酸代謝障礙的NTDs小鼠模型，應用甲氨蝶呤抑制二氫葉酸還原酶[6]；RTX、5FU抑制胸苷酸合成酶[7-8]分別阻斷了由葉酸生成四氫葉酸及dUMP生成dTMP的過程。而HU阻斷了由三磷酸核苷(NTP)生成脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的過程，從而誘導出NTDs動物模型。通過比較發現，阻斷葉酸代謝不同靶點，均可誘導出NTDs小鼠模型。葉酸是體內必須由食物供給的一種水溶性B族維生素。葉酸缺乏時，體內葉酸相關的代謝尤其是一碳單位的代謝發生紊亂，從而影響了核苷酸及胸苷酸的合成，影響蛋氨酸循環及多種物質的甲基化過程。因此葉酸在胚胎神經發育過程中發揮著重要的作用[10]。

NTDs是遺傳因素(多基因遺傳)和環境因素(葉酸缺乏、高溫、高熱、藥物致畸、有害物質等)交互作用的結果。目前，已知有超過幾百個基因的突變會導致小鼠NTDs的發生，在人群中同樣發現這些基因與NTDs的發生相關[11]，但基因突變小鼠模型改變了基因完整性，不能很好的模擬葉酸缺乏引起NTDs的真實情況。很早就有利用環境因素(高溫)構建NTDs動物模型[12]來研究細胞增殖和凋亡對神經管閉合的影響。還有通過控制營養因素構建模型，研究結果顯示孕鼠高糖引起神經上皮細胞過度凋亡，而細胞增殖受到抑制[13]。也有研究者選擇了藥物或者有害物質誘導構建小鼠NTDs模型。有的通過維甲酸灌胃誘導構建小鼠NTDs模型[14]，在胚胎11.5 d時NTDs小鼠的腦部和脊椎觀察到神經上皮細胞大面積的凋亡。有的研究者通過乙硫氨酸誘導NTDs小鼠模型，該模型中葉酸代謝產物降低，神經上皮細胞出現增殖和凋亡的失衡[15]。本研究通過HU誘導構建的NTDs小鼠模型中也發現了神經上皮細胞增殖和凋亡的失衡。這些研究為進一步揭示NTDs的發生機制提供了良好的動物模型。

細胞增殖和凋亡始終貫穿于神經管發育的整個過程，當環境因素改變會引起細胞增殖凋亡失衡，引起神經管閉合障礙。小鼠神經管的發育從E 7.5 d，開始出現神經板，E 8 d位于后腦和頸部交界的第一閉合點，以拉鏈方式同時向頭側方向和尾側方向進行，分別形成將來的腦和脊髓，閉合失敗會引起顱脊柱裂和開放式脊柱裂。在 E 9 d，位于中前腦和中腦的第二閉合點向頭尾兩端閉合，閉合失敗會引起露腦畸形[16]；位于前腦喙末端的第三閉合點單向閉合，閉合失敗會造成顏面畸形[17]。本研究選擇在孕7.5 d通過腹腔注射進行誘導，對第一閉合點和第二閉合點的影響最大，神經管閉合失敗，因此，本研究誘導的4種NTDs小鼠模型中，其表型主要為露腦畸形，也有一部分顏面畸形。神經上皮細胞大量增殖，需要更多的DNA、RNA合成的原料[18]。而葉酸代謝通路參與了這些原料的合成過程，阻斷代謝中關鍵酶的活性，造成代謝紊亂，發生DNA合成障礙。前期通過MTX誘導的NTDs小鼠中，觀察到基因組不穩定性導致CNV的改變[19]，細胞增殖凋亡異常，易引起結構缺陷。

胚胎發育是一個精準的生物調控過程，需要細胞的增殖和凋亡處于動態平衡。在神經管形成時期，細胞增殖旺盛其周期為4～6 h，在發育晚期細胞的增殖分裂速度才開始減慢。細胞凋亡有助于胚胎發育中腦泡的塑型，有報道，在孕8 d時，可以在胎腦的中腦發現大量的細胞凋亡[20]。神經管發育依賴神經上皮細胞增殖、凋亡相互平衡協調，如果這種平衡被打破，勢必影響神經管發育，在本研究誘導的NTDs模型中發現，神經上皮細胞中的PCNA蛋白的表達水平在NTDs組顯著降低，Caspase-3蛋白的表達水平在NTDs組中的表達水平明顯高于正常對照組，其中HU組高于其他組。進一步通過免疫組化檢測，發現在端腦的管壁室管膜層看到神經上皮細胞在周期性增殖的遷移，正常對照組的增殖高于畸形組，畸形組的凋亡高于正常對照組。DNA合成速率下降，DNA錯摻比率增加，復制異常甚至DNA斷裂影響修復，基因組不穩定性增加，誘導細胞發生過度凋亡。加劇了神經發育時期細胞增殖和凋亡的失衡。并且與本課題組前期誘導構建的葉酸代謝通路中其他3組不同靶點的NTDs小鼠模型進行比較，驗證了葉酸涉及的不同的代謝途徑可以獨立地引起 NTDs 發生，同時再次驗證和重復出細胞增殖凋亡失衡會引起NTDs的發生。

本研究從葉酸代謝障礙的角度，通過干擾新的葉酸相關代謝通路中的核苷酸還原酶，誘導構建出NTDs小鼠模型。并且與前期構建的NTDs小鼠模型進行比較，發現葉酸代謝涉及到的不同通路的異常，均可影響細胞增殖和凋亡的平衡，為進一步研究NTDs提供了更多的模型和思路，為NTDs的防控提供實驗依據。

A-B showed theembryo development for control and HU treatment at GD13.5, under dissecting microscope (scale bars:1mm). A:control embryo; B:exencephaly. C-D showed the HE staining resultsfor control and exencephaly embryos at GD13.5 (scale bars:100um). C:control embryo; D:exencephaly.圖1 13.5 d正常胎鼠和HU誘導的腦膨出胎鼠的大體形態和HE染色情況Figure 1 Morphological and HE staining results of normal and exencephaly embryos induced by HU at GD13.5.

A:PCNA immunohistochemical results of neuroepithelium from telencephalon in normal embryos. C:PCNA immunohistochemical results of neuroepithelium from telencephalon in exencephaly embryos. B, D:the magnification of black area in A and C, respectively.E:Statistical comparison on the number of positive cells.圖2 正常胎鼠和HU誘導的腦膨出胎鼠端腦的PCNA的免疫組化情況Figure 2 Immunohistochemical analyses for the expressions of PCNA in the normal and exencephaly embryos induced by HU.

A:Caspase-3 immunohistochemical results of neuroepithelium from telencephalon in normal embryos. C:Caspase-3 immunohistochemical results of neuroepithelium from telencephalon in exencephaly embryos. B, D:The magnification of black area in A and C, respectively.E:Statistical comparison on the number of positive cells.圖3 正常胎鼠和HU誘導的腦膨出胎鼠端腦的Caspase-3的免疫組化情況Figure 3 Immunohistochemical analyses for the expressions of Caspase-3 in the normal and exencephaly embryos induced by HU