和營清熱方及其主要單體抗糖基化終末產(chǎn)物生成研究

王蕾蕾，俞瑩，陶津華，孔令春，繆晚虹，鄒紅

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是一種以視網(wǎng)膜微血管病變?yōu)橹饕±碜兓奶悄虿?yán)重并發(fā)癥。在眾多病理進(jìn)程中糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的積累是DR 發(fā)生的重要機(jī)制之一[1]，它是由過多積累的糖與脂質(zhì)、蛋白、核苷酸攜帶的游離氨基酸結(jié)合形成，能夠誘導(dǎo)周細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞增生，破壞視網(wǎng)膜血管的完整性，導(dǎo)致血管滲漏、微血管瘤的形成等。此外，AGEs 的過多積累還可以引起多種因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、細(xì)胞間粘附因子-1（intercellular adhersion molecule-1，ICAM-1）的過度表達(dá)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜中的血管新生、白細(xì)胞停滯。AGEs 與AGEs 受體（receptor for AGES,RAGE）結(jié)合時(shí)引發(fā)炎癥，導(dǎo)致血栓生成[2]，加重DR。故AGEs 的生成是DR 產(chǎn)生的一個(gè)重要病理因素，探索抑制其合成對控制DR 的發(fā)展具有積極作用。

和營清熱方（heying qingre formula，HF）是上海名老中醫(yī)鄒菊生先生的經(jīng)驗(yàn)方，臨床用于治療早期DR。本課題通過使用和營清熱方及其主要單體干預(yù)體外糖基化終末產(chǎn)物合成過程，探討其保護(hù)DR 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

中藥生藥（購于香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥房）；糖基化終末產(chǎn)物（Millipore 公司，美國）；氨基胍（Sigma 公司，美國）；乙腈，HPLC 級（DUKSAN 公司，日本）；綠原酸、牛蒡子苷、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、梓醇，HPLC≥98%（上海融禾藥物股份有限公司）；葡萄糖、果糖（Sigma 公司，美國）。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（Waters 公司，美國）；C18 色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm，ACE，英國）；熒光光譜儀（LS55，PerkinElmer，美國）。

1.3 中藥提取及成分鑒定

HF 共含8 味中藥，分別為金銀花、當(dāng)歸、玄參、生地黃、枸杞子、黃精、蒲公英、牛蒡子，除蒲公英（為其他藥的2.5 倍量），其他各藥等量。生藥經(jīng)粉碎、混合后，浸泡在10 倍體積的去離子純凈水中，水煎2 次，每次1h。混勻兩次水煎液通過真空蒸餾濃縮為2 g/ml，過濾后儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

為鑒定該復(fù)方中有效化學(xué)成分，本研究使用高效液相色譜法對其進(jìn)行檢測。經(jīng)篩選，查閱文獻(xiàn)后選取綠原酸、牛蒡子苷、阿魏酸、蘆丁、槲皮素及梓醇單體標(biāo)準(zhǔn)品為藥物單體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定，選用乙腈與0.05%KH2PO4（pH=2.5）為流動(dòng)相，色譜分離條件如表1 所示，檢測波長為235 nm。

表1 和營清熱方的高效液相色譜分析條件

1.4 造模方法

糖基化終末產(chǎn)物合成模型建立，以果糖為基底合成AGEs：10 g/L 牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）與250 mM 果糖溶解于0.2 M 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）中，無菌條件下置于37℃培養(yǎng)6 d。以葡萄糖為基底合成AGEs：將50 mg/ml BSA 與144 mg/ml 葡萄糖溶于0.2 M PBS（pH=7.4）中，無菌條件置于37℃培養(yǎng)7 d。

1.5 分組及給藥方法

在以果糖和葡萄糖為底物合成糖基化終末產(chǎn)物的模型組的基礎(chǔ)上，加入氨基胍、HF 溶液或HF 主要單體成分觀察HF 或單體對其合成有無抑制作用。分組依次為：（1）空白對照：BSA+PBS；（2）模型組：給藥方法詳見造模方法（以果糖或葡萄糖為基底）；（3）陽性對照組：模型組+氨基胍（20 mM）；（4）HF 組：模型組+不同濃度HF（分別為8、40、200、1000 μg/ml）；（5）綠原酸組：模型組+不同濃度綠原酸（分別為0.08、0.4、2、10 mM）；（6）阿魏酸組：模型組+不同濃度阿魏酸（分別為0.08、0.4、2、10 mM）；（7）牛蒡子苷組：模型組+不同濃度牛蒡子苷（分別為0.08、0.4、2、10 mM）。

1.6 觀察指標(biāo)

培養(yǎng)結(jié)束后，使用PerkinElmer 熒光光譜儀檢測各組熒光值，激發(fā)波長及發(fā)射波長分別設(shè)置為370 nm及440 nm。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則用表示，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則用中位數(shù)形式表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett T3 檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和營清熱方抑制糖基化終末產(chǎn)物體外合成

通過體外合成AGEs 觀察HF 是否能夠抑制其生成。結(jié)果顯示，無論是在葡萄糖為底物還是以果糖為底物時(shí)，與正常組相比，模型組能夠明顯提高AGEs 的含量（果糖組P=0.000，葡萄糖組P=0.000）；與模型組相比，陽性對照藥物氨基胍能夠明顯降低AGEs 的含量（果糖組P=0.000，葡萄糖組P=0.000）。

2.1.1 以果糖為底物合成AGEs 培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=925.114，P=0.000。與模型組相比，濃度為8 μg/ml 和營清熱方具有促進(jìn)AGEs 合成的功能，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018），但濃度為40 μg/ml（P=0.023），200 μg/ml（P=0.000）及1000 μg/ml（P=0.000）能夠降低AGEs 合成量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)（圖1）。

圖1 和營清熱方抑制以果糖為底物體外合成糖基化終末產(chǎn)物。圖2 和營清熱方抑制以葡萄糖為底物體外合成糖基化終末產(chǎn)物。

2.1.2 以葡萄糖為底物合成AGEs 培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=2030.920，P=0.000。與模型組相比，濃度為8 μg/ml 和營清熱方也具有促進(jìn)AGEs 合成的功能，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036），濃度為40 μg/ml干預(yù)組無明顯差異（P=0.546），而濃度為200 μg/ml（P=0.000）及1000 μg/ml（P=0.000）HF 干預(yù)組能夠降低AGEs 合成量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)（圖2）。以上說明和營清熱方能夠顯著抑制AGEs 的體外合成，濃度越大，抑制作用越明顯。

圖3 和營清熱方的指紋圖譜。峰3 綠原酸；峰5 阿魏酸；峰8 牛蒡子苷

2.2 和營清熱方的指紋圖譜

本研究使用HPLC 對HF 提取物進(jìn)行質(zhì)譜分析，共分離出10 個(gè)色譜峰。通過比對綠原酸、牛蒡子苷、阿魏酸、蘆丁、槲皮素及梓醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間及紫外光譜，共鑒定出3 個(gè)單體成分，分別為綠原酸（峰3）、阿魏酸（峰5）及牛蒡子苷（峰8）（圖3）。

2.3 HF 的3 種主要單體干預(yù)糖基化終末產(chǎn)物體外合成作用

本研究又分別使用篩出的3 種主要單體：綠原酸、阿魏酸、牛蒡子苷分別干預(yù)糖基化終末產(chǎn)物體外合成過程，每種藥物濃度均依次為0.08 mM，0.4 mM，2 mM，10 mM，觀察該3 種單體是否有抑制糖基化終末產(chǎn)物合成的作用。結(jié)果顯示，3 種單體干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，只有綠原酸對以葡萄糖或果糖為基底合成的糖基化終末產(chǎn)物合成顯示出良好的抑制作用（圖4），阿魏酸和牛蒡子苷無明顯作用甚至促進(jìn)作用（圖5、6）。

圖4 綠原酸抑制糖基化終末產(chǎn)物合成。4A 以葡萄糖為底物；4B 以果糖為底物

圖5 阿魏酸干預(yù)糖基化終末產(chǎn)物合成。5A 以葡萄糖為底物；5B 以果糖為底物

圖6 牛蒡子苷干預(yù)糖基化終末產(chǎn)物合成。6A 以葡萄糖為底物；6B以果糖為底物

2.3.1 綠原酸 干預(yù)以葡萄糖為基底合成AGEs 實(shí)驗(yàn)中（圖4A），培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=77.672，P=0.000。與模型組相比，4 種濃度的綠原酸均能降低AGEs 合成，但濃度為0.08 mM 的藥物組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.234），同時(shí)濃度為0.4 mM（P=0.001）、2 mM（P=0.002）及10 mM（P=0.000）的綠原酸具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在以果糖為基底合成AGEs 實(shí)驗(yàn)中（圖4B），培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=119.999，P=0.000。與模型組相比，低濃度綠原酸包括0.08 mM 和0.4 mM具有促進(jìn)AGEs 合成的作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073，P=0.080），但濃度為2 mM、10 mM 綠原酸能夠抑制AGEs的體外合成，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000,P=0.000）。

2.3.2 阿魏酸 干預(yù)以葡萄糖為基底合成AGEs 實(shí)驗(yàn)中（圖5A），培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=114.971，P=0.000。與模型組相比，低濃度0.08 mM（P=0.361）及0.4 mM（P=0.236）阿魏酸輕度抑制AGEs 合成，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。稍高濃度2 mM（P=0.019）和10 mM（P=0.008）阿魏酸具有促進(jìn)AGEs 合成作用，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在以果糖為基底合成AGEs 實(shí)驗(yàn)中（圖5B），培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=81.236，P=0.000。與模型組相比，4 種濃度具均具有促進(jìn)AGEs 合成作用，但僅0.4 mM（P=0.003）及2 mM（P=0.000）組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 牛蒡子苷 干預(yù)以葡萄糖為底物合成AGEs實(shí)驗(yàn)中（圖6A），培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=38.924，P=0.000。與模型組相比，僅有高濃度組10 mM 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030），且存在促進(jìn)AGEs 合成作用，余3種濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在以果糖為底物合成AGEs 實(shí)驗(yàn)中（圖6B），培養(yǎng)末AGEs 濃度組間比較，F(xiàn)=115.161，P=0.000。與模型組相比，4 種濃度均存在促進(jìn)其合成作用，且3 種較高濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.4 mM 組P=0.000，2 mM 組P=0.000，10 mM 組P=0.000）。

3 討論

上海名老中醫(yī)鄒菊生先生認(rèn)為，糖尿病變生目疾病機(jī)為胃火偏旺，灼津成瘀，留阻脈道，脈絡(luò)瘀滯，久瘀成熱，瘀熱則津傷，血不循經(jīng)則溢于脈外，后期久病致氣陰兩虛。故針對早期糖尿病視網(wǎng)膜病變，他主張以和營清熱為主，以外科治療脈管炎經(jīng)典方——四妙勇安方加蒲公英等助銀花清熱解毒之效，生地助玄參滋陰增液活血之效等，擬名和營清熱方進(jìn)行治療。其臨床療效已被多次驗(yàn)證[3-4]，其對非增殖期、增殖期糖尿病視網(wǎng)膜患者，以及聯(lián)合激光進(jìn)行干預(yù)該病，均可有效提高患者視力，改善其眼底滲出、黃斑水腫等眼底改變，提高治療療效。

過多的血糖使得糖基化終末產(chǎn)物大量積累，糖尿病造成大量AGEs 積累，除了誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞功能紊亂外，還能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子VEGF、MCP-1、ICAM-1 表達(dá)，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、NADPH，從而加速DR 發(fā)生[7-8]。AGEs 即葡萄糖、果糖等還原糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核算的氨基殘端結(jié)合，經(jīng)過一系列復(fù)雜的非酶促美拉德反應(yīng)如脫水、重排、壓縮而形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆的復(fù)雜聚合物。現(xiàn)代研究多采用生物化學(xué)方法以白蛋白、葡萄糖或果糖為底物，模擬人體恒溫、無菌條件，體外培養(yǎng)數(shù)日合成該物質(zhì)，通過使用熒光光譜儀檢測熒光強(qiáng)度，用來確定AGEs 的濃度[9]。氨基胍是目前基礎(chǔ)研究方面最為有效的抑制AGEs 的抑制劑[10]，但由于潛在的毒性及副作用未能成功應(yīng)用于DR 病人[11]，尋找抑制AGEs 形成的藥物是DR 的重要潛在治療方法。

隨著中醫(yī)藥逐步走向國際化，研究方法也逐漸向國際標(biāo)準(zhǔn)化靠攏。中藥復(fù)方的組成較為復(fù)雜，藥物單體是復(fù)方構(gòu)成的基礎(chǔ)成分，所以本實(shí)驗(yàn)通過液相質(zhì)譜分析篩選出主要單體，并探究其是否與主方功效一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HF 全方具有明顯抑制AGEs 合成的作用，其組成單體之一綠原酸也顯示同樣的作用，但同時(shí)其另外兩種組成單體牛蒡子苷和阿魏酸卻無明顯抑制作用，甚至存在促進(jìn)AGEs合成的功效。國外文獻(xiàn)中也曾有過類似報(bào)道，Kim[12]等人發(fā)現(xiàn)綠原酸能夠抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中AGEs 的生成，且能降低AGE/RAGE 復(fù)合體的活性，從而發(fā)揮對AGEs 的保護(hù)作用。由此提示，HF 對于AGEs 的合成具有良好的抑制作用，且綠原酸是HF中發(fā)揮抗AGEs 合成的重要有效成分之一，這可能是HF 發(fā)揮良好抗AGEs 的重要藥理機(jī)制。

HF 的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，綠原酸并非HF 的唯一組成單體，也并非HF 中含量最多的單體。由此可見，中藥復(fù)方中發(fā)揮某一藥理作用的不一定是其主要組成單體，單體的作用功效與其含量未必成正相關(guān)關(guān)系。中藥復(fù)方在炮制過程中單體之間很可能形成了新的化合物或發(fā)生了某種化學(xué)反應(yīng)，通過簡單的單體樣品檢測未必能夠發(fā)現(xiàn)這些新成分的存在，所以在研究中藥復(fù)方的有效作用成分中，使用更為精確的檢測方法十分必要。另外，本實(shí)驗(yàn)是探索HF 及單體抗AGEs 合成作用，雖然本實(shí)驗(yàn)中牛蒡子及阿魏酸與主方?jīng)]有體現(xiàn)藥理作用的一致性，但仍有可能以其他機(jī)制發(fā)揮保護(hù)DR 作用，共奏臨床療效，所以探索HF 的其他有效成分及藥理機(jī)制需要進(jìn)一步研究。