一種高通量檢測方法評估多種殺蟲劑協同作用于蜜蜂的毒性風險

劉玉玲 李興安 王志 陳東海 牛慶生│編譯

吉林省養蜂科學研究所，吉林132108

蜜蜂幾乎總是暴露在殺蟲劑之中。最近，我們進行了一項檢測蜂巢蠟質中殺蟲劑殘留的研究，受檢對象是紐約198名養蜂人的蜂巢蠟質，結果顯示197名養蜂人的蜂巢蠟質有殺蟲劑殘留，蜂巢蠟質平均含有6種殺蟲劑。而這不算糟糕，研究僅是證明蜜蜂通常暴露于低劑量的殺蟲劑。2019年，我們進行一項蜂箱飼料中殺蟲劑殘留的研究，受檢對象是紐約蘋果園授粉蜜蜂的蜂箱飼料，結果顯示蜂箱飼料平均含有14種殺蟲劑，而且一些蜂箱飼料最多含有23種殺蟲劑。

多種殺蟲劑毒作用蜜蜂的現狀給美國環境保護署（EPA）等環境監管機構進行殺蟲劑風險評估提出一個重要問題：如何確定特定環境下殺蟲劑的使用劑量，以及如何限制其毒作用風險的使用劑量。然而，美國環境保護署和其他環境監管機構僅考慮如何評估殺蟲劑單獨使用的毒性風險，沒有考慮如何評估多種殺蟲劑聯合使用的毒性風險。為此，我們草擬了一個不算完整的殺蟲劑毒作用風險圖例：首先，蜜蜂在飼養過程中不可避免地接觸殺蟲劑；其次，一些殺蟲劑通過相互作用（即協同作用）大大增加了自身的毒性，比單一殺蟲劑具有更大的毒作用。

當蜜蜂同時暴露于數百種殺蟲劑時，我們該如何評估多種殺蟲劑聯合作用于蜜蜂的毒性風險呢？簡單的數學計算方法是，如果1只蜜蜂同時暴露于100種殺蟲劑，那么想評估2種殺蟲劑組合暴露對蜜蜂的毒作用，就需要組織4950次實驗才能進行總的風險評估；想評估3種殺蟲劑組合暴露對蜜蜂的毒作用，就需要組織161700次實驗才能進行總的風險評估。以此類推，該如何評估14種殺蟲劑組合暴露對蜜蜂的毒作用？也就是說，需要組織多少次實驗才能獲得上述紐約蘋果園授粉蜜蜂的蜂箱飼料檢測結果呢？答案非常令人吃驚，是44186942677323600次實驗。

圖1 熒光掃描384微孔板檢測殺蟲劑干擾蜜蜂CYP9Q3解毒酶催化BCF底物生成基-4-三氟甲基香豆素（HC）產物的技術原理

如果要解決這個重要問題，需要開發一種快速而有效的篩選方法，以明確蜜蜂是否面臨多種殺蟲劑協同作用的毒性風險。為了回答這個問題，我們實驗室提出第39個研究課題：蜜蜂細胞色素P450酶用于分子檢測殺蟲劑毒作用的風險評估指標。這項研究旨在傳統的評估殺蟲劑毒性風險基礎上增加一種新方法。Julian Haas和Ralf Nauen將研究成果發表于美國環境科學類期刊《環境國際》（2021,147:106372）。

通過參考實驗室初步篩選人藥檢測方法，以確定蜜蜂體內是否存在藥物與藥物之間的相互作用。首先，通過體外實驗在384微孔板建立殺蟲劑抑制CYP9Q3解毒酶的活力測定方法，CYP9Q3解毒酶是細胞色素P450 基因CYP9Q3編碼的藥物代謝酶異構體，能夠將殺蟲劑分解為無毒產物；其次，通過體內實驗檢測殺蟲劑對蜜蜂CYP9Q3解毒酶的活力影響；最后，比較體內、外檢測結果。

在384微孔板圖片上方，CYP9Q3解毒酶將BFC底物分解為HC產物。在殺蟲劑存在時，CYP9Q3解毒酶不能將BFC全部轉化為HC (箭頭顯示)，存在兩個可能：一種原因是殺蟲劑充當BFC的競爭性底物，也被CYP9Q3解毒酶降解，噻蟲啉（TCP）、啶蟲脒（ACT）等新煙堿類殺蟲劑在蜜蜂體內能夠被CYP9Q3解毒酶降解；另一種原因是殺蟲劑充當酶的抑制劑，使CYP9Q3解毒酶在降解其他類似底物時活力降低。稍后我們看到，一些殺真菌劑通過抑制CYP9Q3解毒酶的活性，干擾蜜蜂對噻蟲啉（TCP）和啶蟲脒（ACT）的解毒能力。在384微孔板圖片下方，微孔板檢測實驗的不同結果是：比之于正常的CYP9Q3解毒酶的酶促反應（淺色曲線），CYP9Q3解毒酶被殺蟲劑抑制后在添加更多BFC底物時沒有產生更多數量HC（深色曲線），這意味著殺蟲劑干擾了CYP9Q3解毒酶的正常催化活性，成為CYP9Q3解毒酶的競爭性底物，或者成為CYP9Q3解毒酶的抑制劑。

現在看來，微孔板檢測實驗通過測定蜜蜂CYP9Q3解毒酶的酶活力提供如下3個方面的研究證據。首先，蜜蜂CYP9Q3解毒酶是否能夠降解噻蟲啉（TCP）、啶蟲脒（ACT）、吡蟲啉、噻蟲嗪等新煙堿類殺蟲劑以及擬除蟲菊酯類殺蟲劑（也被用作滅螨劑）；其次，三氟咪唑、丙環唑、三唑酮、環氧環唑、烯唑環唑、丙硫菌唑、丙氯唑和偶氮菌酯等殺真菌劑是否干擾蜜蜂CYP9Q3解毒酶；最后，噻蟲啉（TCP）和啶蟲脒（ACT）是否單獨毒作用于蜜蜂，還是與殺真菌劑共同毒作用于蜜蜂。比較體外實驗獲得的LC50值與體內實驗獲得的LD50值，就找到了問題的答案。

微孔板檢測法是否證明上述殺蟲劑被蜜蜂CYP9Q3解毒酶分解? 一些結果是肯定的，例如，蜜蜂CYP9Q3解毒酶能分解噻蟲啉（TCP）、啶蟲脒（ACT）和氟纈氨酸；而另外一些結果是否定的，例如，蜜蜂CYP9Q3解毒酶不能分解吡蟲啉和噻蟲嗪。微孔板檢測法是否證明上述殺真菌劑抑制蜜蜂CYP9Q3解毒酶? 結果也是既有肯定的也有否定的。這項研究展示Julian Haas和Ralf Nauen研究成果的新突破，換句話說，就蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制而言，所有殺真菌劑的效果并不相同。

那么，有證據表明殺真菌劑與殺蟲劑之間存在協同性？有，看看蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效應（LD50）就清楚。微孔板檢測實驗通過評估蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效應（LD50），可以預測啶蟲脒（ACT）與8種殺真菌劑存在協同作用。此外，還測試另一種蜜蜂CYP9Q2解毒酶，發現這個酶的酶活力下降與蜜蜂死亡率之間存在更好的相關性。

顯然，Julian Haas和Ralf Nauen關于殺蟲劑毒性與蜜蜂致死效應之間的相關分析，提供了一種蜜蜂殺蟲劑毒性風險評估的檢測方法，也提高了人們對殺蟲劑毒作用機制的認識水平。鑒于微孔板檢測實驗具有高通量分析的技術優勢，CYP9Q3解毒酶的活性測定在快速篩選多種農藥組合毒性作用方面具有巨大開發潛力。在本研究中，某些殺蟲劑之間存在強的協同作用，例如，咪鮮胺（PRC）能夠將噻蟲啉（TCP）的致蜜蜂急性毒作用水平提高到700倍，而且人們已經認識到殺蟲劑協同作用增加了蜜蜂的致死效應，因此微孔板檢測結果對美國環境保護署等監管機構的影響被低估了。

Julian Haas和Ralf Nauen的這項研究提示我們，擴大微孔板檢測范圍（例如，蜜蜂其他解毒酶和其他酶系統）會非常重要。在本研究中，蜜蜂CYP9Q3解毒酶僅對噻蟲啉（TCP）和啶蟲脒（ACT）等新煙堿類殺蟲劑具有明顯的降解作用，但是對吡蟲啉、噻蟲嗪等其他新煙堿類殺蟲劑沒有降解作用。蜜蜂CYP9Q3解毒酶對其他類型殺蟲劑有降解作用嗎？例如，有機磷殺蟲劑，氨基甲酸酯殺蟲劑，以及最近公布的蜜蜂急性毒性低毒類化學殺蟲劑？除此之外，還有蜜蜂其他酶或非酶系統用來評估殺蟲劑協同毒性?

Julian Haas和Ralf Nauen通過這項研究向我們開啟了一個非常重要的研究：我們該如何通過后續實驗證明微孔板檢測方法的可行性，以改進蜜蜂暴露于多種殺蟲劑的風險評估方法。