不同品種淫羊藿黃酮類有效成分的主成分分析及對腎陽虛大鼠保護作用的研究

楊 洋，尹程程，陳昊媛，李佳奇，趙大慶，睢博文，齊 濱*

1長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院；2長春中醫藥大學藥學院，長春 130117

淫羊藿為小檗科植物巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Ying、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉，4個種收載在2015版《中華人民共和國藥典》[1]。本藥始載于《神農本草經》，列為上品，別名諸多，《本經》中稱剛前，《雷公炮炙論》中稱仙靈脾，《日華子本草》中稱放杖草、棄杖草、千兩金、干雞筋、黃連祖。《別錄》、《藥性論》、《蜀本草》以及《滇南本草》皆有記載，其性味辛、甘、溫，歸肝、腎二經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效[2-7]。現代藥理學研究表明，淫羊藿能興奮性機能，提高人體免疫力，調節心臟供血供氧平衡，改善心腦缺血缺氧，促進造血功能，防治骨質疏松，亦有抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁、抗炎等作用[8]。淫羊藿的化學成分包括黃酮、木脂素、苯酚苷、生物堿、多糖、揮發油、微量元素、有色原酮、菲、蒽醌、鞣質、倍半萜、甾醇等[9]，其中，黃酮類成分如淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C為其主要活性成分[10]。主成分分析法是常用的對樣本信息進行綜合評價的方法之一，在中藥領域的應用彌補了中藥質量優劣評價中各指標權重的不確定性及某些指標間存在的相關性帶來的不便,進一步完善了中藥質量評價方法[11]。本研究采用采用高效液相色譜法，對其黃酮類主要有效成分淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C進行了含量測定，并結合主成分分析對淫羊藿進行了綜合性評價，近期查閱文獻得知，淫羊藿主要集中在免疫調節、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等活性的研究，關于淫羊藿的補腎陽作用研究甚少，所以我們對其補腎陽的作用進行初步的探究。為淫羊藿的臨床應用提供科學的理論依據和醫用基礎。

1 材料

1.1 樣品采集

選擇4個品種的淫羊藿，每個品種各3批，12個不同來源淫羊藿藥材均來自各個主產區，經長春中醫藥大學藥學院肖井雷副教授鑒定均為為小檗科植物巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Ying、箭葉淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.和朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai的干燥葉。樣品來源見表1。

表1 淫羊藿藥材樣品來源情況Table 1 Source of Herba Epimedii samples

1.2 藥品與試劑

淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C(南京森貝伽生物科技有限公司)；氫化可的松注射液(河南潤弘制藥股份有限公司)；乙腈、超純水、無水乙醇、二甲苯、乙酸、生理鹽水(北京化工廠)；水合氯醛(北京酷來搏科技有限公司)；HE染色試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；尿酸(UA)試劑盒(酶比色法)、尿素氮(BUN)ELISA試劑盒、肌酐(Cr)ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；金匱腎氣丸(北京同仁堂制藥廠)；石蠟(52～54 ℃，上海華永石蠟有限公司)。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g，由依思實驗動物科技公司提供.將動物實驗室溫度控制在24±2 ℃，濕度控制在55%±5%，光照時間為6∶30～18∶00。適應性喂養3天，進食普通飼料，自由飲水。

1.4 儀器

紫外可見分光光度計(UV-2550型，日本島津公司)；高效液相色譜儀(LC-1100 型，安捷倫公司)；安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm，安捷倫公司)；粉碎機(AK-400A，溫嶺市奧力中藥機械有限公司)；分析天平(梅特勒MS204S型，瑞士梅特勒-托利多公司)；注射器(20180918，江蘇治宇醫療器械有限公司)；灌胃器(20170923，江蘇治宇醫療器械有限公司)；全自動生化分析儀(CX4，美國貝克曼公司)；移液槍(OH37709，Thermo儀器公司)；自動包埋機(EG1150H型，德國LEICA)；手搖切片機(RM2235型，德國LEICA)；烘片機(HI1220型，德國LEICA)；鋪片機(HI1210型，HI1210型)；體視顯微鏡(SMZ25，尼康儀器有限公司)。

2 方法

2.1 4 種活性成分含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以水為流動相B；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；270 nm檢測波長；理論板數按淫羊藿苷峰計算應不低于1 500。

表2 流動相梯度洗脫表Table 2 Mobile phase gradient elution table

2.1.2 對照品溶液的制備

取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL各含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗

分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品儲備液各10 μL，連續進樣6次，計算峰面積，得出RSD值。

2.1.5 穩定性試驗

精密吸取按“2.1.2”項下混合對照品儲備液各10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算峰面積，得出RSD值。

2.1.6 重復性試驗

精密稱取淫羊藿6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算峰面積，得出RSD值。

2.1.7 線性關系考察

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，分別置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成系列濃度對照品溶液。分別吸取上述七份對照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件檢測。以各對照品溶液的濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。

2.1.8 加樣回收率實驗

取淫羊藿藥材粉末(S1)6份，精密稱定每份0.25 g，定量加入淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C對照品適量，按“2.1.3”項制備供試品溶液并進樣分析，記錄各化學成分峰面積并計算含量，按“2.1.1”項下方法進樣檢測。

2.2 樣品含量測定

取“2.1.2”項下混合對照品溶液和“2.1.3”項下供試品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。計算出各樣品中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的含量。

2.3 主成分分析

主成分分析法是常用的對樣本信息進行綜合評價的方法之一，在中藥領域的應用彌補了中藥質量優劣評價中各指標權重的不確定性及某些指標間存在的相關性帶來的不便,進一步完善了中藥質量評價方法[11]。通過IBM SPSS 21.0統計軟件，對12淫羊藿進行降維和因子分析，計算成分特征值、貢獻率及特征向量。

2.4 腎陽虛大鼠保護作用

2.4.1 造模、分組與給藥

取SD雄性大鼠40只，將34只大鼠每日腹腔注射氫化可的松注射液，給藥劑量為100 mg/kg；剩余6只大鼠作為正常對照組，注射等體積生理鹽水，連續四周。四周后挑選30只造模成功的大鼠隨機分為陽虛模型對照組(模型組)、金匱腎氣丸干預組(陽性組)、淫羊藿水提物低劑量組(YYH-LG組)、淫羊藿水提物中劑量組(YYH-MG組)和淫羊藿水提物高劑量組(YYH-HG組)。干預組給藥量按照人鼠等效劑量折算。陽性組給予金匱腎氣丸水溶液灌胃；淫羊藿干預組給予淫羊藿提取物濃縮液灌胃；模型組與空白對照組灌胃等體積蒸餾水。灌胃體積均為10 mL/kg，連續灌胃四周。

2.4.2 取材

連續給藥30天，最后一天給藥后24 h內禁食不禁水，采用水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，以3 000 rpm速率離心10 min，取上層血清，分裝，凍存于-20 ℃備用。取大鼠腎臟，置于20倍體積4%多聚甲醛中固定24 h，備用。

2.4.3 生化指標檢測

采用全自動生化分析儀檢測尿酸(UA)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)的含量。

2.4.4 HE染色

按照HE染色試劑盒說明對組織切片進行染色。

2.4.5 數據分析

臟器指數計算公式：

臟器指數=(臟器質量/體重)×100%

3 實驗結果

3.1 4種有效成分含量測定結果

3.1.1 方法學考察

方法學考察結果見表3，結果表明，該方法精密度、重復性、穩定性良好，符合含量測定要求。

表3 方法學考察結果(n=6)Table 3 Methodology (n=6)

3.1.2 線性考察結果

線性考察結果見表4。結果表明淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C，R2>0.999,線性關系良好，符合含量測定要求。

表4 4種指標性成分線性范圍Table 4 Linear relationships of four constituents

3.1.3 加樣回收率結果

加樣回收率實驗結果如表5所示，加樣回收率

表5 加樣回收率試驗結果(n=6)Table 5 Results of recovery test(n=6)

均高于98%，加樣回收試驗結果良好。

3.1.4 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量測定結果

對12批淫羊藿淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C進行含量測定，測定結果如表6。

表6 不同批次淫羊藿淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量測定結果Table 6 The quantification of icariin,epimedin A,epimedin B and epimedin C in different samples

3.2 主成分分析結果

應用SPSS 21.0 統計分析軟件對含量測定結果進行分析，方差貢獻率結果見表7，主成分計算結果見表8。

表7 主成分的方差值和貢獻率Table 7 Characteristic value and variance contribution rate of principle components

表8 主成分分析結果Table 8 Principal component analysis (PCA)

如表7所示，提取特征值大于1的成分，可提取兩個主成分。第一主成分特征值為2.100，方差貢獻率是52.501%；第二主成分特征值為1.322，方差貢獻率是33.059%；根據特征向量矩陣，建立主成分分析模型。

F=52.501%F1+33.059%F2

F1=0.617X1+0.442X2-0.337X3+0.558X4

F2=0.287X1-0.496X2+0.666X3+0.477X4

X1、X2、X3、X4分別為淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C原始變量標準化后的變量。F1、F2為主成分1和主成分2得分。以主成分貢獻率對主成分得分進行加權平均，得綜合評分F。結果見表9，如表9所示，選擇得分較高的柔毛淫羊藿，進行腎陽虛保護作用試驗。

表9 12批淫羊藿藥材樣品得分Table 9 Score of 12 batches of Epimedium medicinal herbs samples

3.3 藥理實驗結果

3.3.1 全身一般情況

造模的大鼠逐漸出現活動減少、精神萎靡、背部弓起、皮毛枯燥、飲水增多等現象，隨著腹腔注射天數的延長，大鼠體重逐漸下降，并伴隨畏寒、毛色灰暗、背部蜷縮等現象。空白對照組大鼠均未見異常情況。經灌胃給予不同劑量淫羊藿提取物與金匱腎氣丸干預后，四組大鼠活動有所增加，以上癥狀也均有所改善。模型組大鼠體重略有回升，但狀態無明顯改善。

3.3.2 臟器指數變化

腎臟指數：如表10所示，與空白組相比，模型組腎臟指數顯著升高(P<0.05)；經金匱腎氣丸與淫羊藿提取物灌胃干預后，與模型組相比，干預組腎臟指數顯著降低(P<0.01)；YYH-LG組腎臟指數較低，YYH-MG組和YYH-HG組腎臟指數基本一致(P>0.05)。

表10 腎臟指數

3.3.3 腎功能

尿酸(UA)：如表11所示，與空白組相比，模型組UA顯著降低(P<0.05)；干預后，干預組UA含量均有上升趨勢，但與模型組無顯著差異(P>0.05)；YYH-LG組UA含量相對較高，YYH-MG組和YYH-HG組UA含量基本一致，無顯著差異(P>0.05)。

肌酐(CRE)：如表11所示，與空白組相比，模型組CRE顯著升高(P<0.05)；干預后，干預組CRE含量均有下降趨勢，與模型組相比均有顯著差異(P<0.01)；與YYH-MG組和YYH-HG組相比，YYH-LG組CRE下降效果較好，且與YYH-MG組有顯著差異(P<0.05)。

尿素氮(BUN)：如表11所示，與空白組相比，模型組BUN顯著升高(P<0.05)；干預后，干預組BUN含量均有下降趨勢，與模型組相比均有顯著差異(P<0.01)；與YYH-HG組相比，組和YYH-HG組相比，YYH-LG組CRE下降效果較好，且與YYH-MG組BUN含量下降趨勢明顯，具有顯著差異(P<0.001)；與組和YYH-HG組相比，YYH-LG組CRE下降效果較好，且與YYH-MG組相比，YYH-LG組和YYH-HG組BUN含量下降趨勢明顯，具有顯著差異(P<0.05)。

表11 UA、CRE、BUN含量變化Table 11 UA,CRE,BUN content changes

3.3.4 組織鏡檢

3.3.4.1 腎臟組織病理變化

如圖1A、B所示，空白組大鼠腎臟組織髓質和皮質分界清晰，腎小管基底膜未見增厚，腎小球和腎間質未見異常。如圖1C、D所示，模型組大鼠腎臟組織中腎小管管腔增大，基底膜增厚，腎小管數目減少；腎小球數目減少，腎小球萎縮，腎小囊腔擴大；腎間質纖維化嚴重。如圖1E～L所示，干預后，與模型組相比，陽性組、YYH-LG組、YYH-MG組和YYH-HG組大鼠腎臟組織中均見腎小管基底膜增厚減輕，腎小管管腔縮小，腎小球萎縮減輕，腎小囊腔基本無擴大跡象，腎間質纖維化減輕。對比干預組腎臟組織，陽性組和YYH-HG組腎臟中腎小球恢復效果較好，數目增加，系膜細胞分布均勻，腎間質纖維化較輕。

圖1 柔毛淫羊藿對腎陽虛大鼠腎組織形態結構的影響Fig.1 Effects of E.pubescens on the morphological structure of kidney tissue in rats with kidney-yang deficiency注：A：空白組(×10)；B：空白組(×40)；C：模型組(×10)；D：模型組(×40)；E：陽性組(×10)；F：陽性組(×40)；G：YYH-LG組(×10)；H：YYH-LG組(×40)；I：YYH-MG組(×10)；J：YYH-MG組(×40)；K：YYH-HG組(×10)；L：YYH-HG組(×40)Note:A:Control group (×10);B:Control group (×40);C:Model group (×10);D:Model group (×40);E:Positive group (×10);F:Positive group (×40);G:YYH-LG group (×10);H:YYH-LG group (×40);I:YYH-MG group (×10);J:YYH-MG group (×40);K:YYH-HG group (×10);L:YYH-HG group (×40).

4 討論與結論

本研究主成分分析結果顯示，將四個成分提取出兩個主成分，第一主成分淫羊藿苷、朝藿定C，第二主成分為朝藿定B。利用貢獻率對主成分進行加權平均，比較12批淫羊藿藥材得分，發現其中有5批樣品得分較低，提示12批樣品質量存在差異。本研究選擇得分較高的柔毛淫羊藿進行接下來的腎陽虛保護作用研究。

在臨床上，腎功能損傷時，UA、CRE和BUN含量會改變[13-16]。在本研究中，以氫化可的松誘導形成的大鼠腎陽虛為實驗對象，以UA、CRE和BUN為檢測指標。結果顯示，YYH-LG組、YYH-MG組和YYH-HG組均可以減少UA、CRE和BUN的含量。總體而言，YYH-LG組對各指標、腎臟損傷改善效果較好。因此，淫羊藿作為藥品在治療腎陽虛中具有重要意義。