定量蛋白質組學篩選及分析山慈菇酯提物抗4T1乳腺癌的新啟示

曹曉東，張 楠，楊冬冬，劉 穎，王 赫，張子英*

1內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心；2內蒙古醫科大學公共衛生學院；3內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 010110；4扎蘭屯職業學院，呼倫貝爾 162650

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是全球第2大高發癌，死亡率在全球排第5[1]。世界范圍內乳腺癌的發病率和死亡率分別占12.2%和9.6%，呈快速增長的趨勢，且發病趨于年輕化，給廣大女性造成了嚴重困擾[2]。三陰性乳腺癌(hriple-negative breast cancer,TNBC)在診斷初期就合并遠處器官轉移，患者的存活率僅為23%，化學治療TNBC雖有一定的療效，但并未延長患者的總生存期和無進展生存期。

國醫大師周仲瑛教授系我國著名中醫藥專家，1 374診次惡性腫瘤病案中共用藥物453味，其中使用頻次最高的為山慈菇，1 062次，占77.29%[3]。山慈菇為中、蒙、苗醫臨床常用抗癌藥，蒙醫常用抗癌方劑益氣托毒中藥湯劑、蒙藥烏門-17味散中均含有山慈菇。山慈菇能明顯抑制人源TNBC類細胞MDA-MB-231和ER+的T-47D細胞的增殖和轉移[4,5]。4T1屬于鼠源的TNBC，本課題組特在相對具有免疫功能BALB/c小鼠上復制了4T1乳腺癌模型，應用TMT標記定量蛋白質組學篩選及分析Cr Ap相關的抗乳腺癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

4T1乳腺癌細胞株(中國科學院細胞庫)；DMEM培養基(Gibco公司)；0.25% Trypsin-EDTA(Gibco公司)；FBS(ExCell Bio公司)；Penicillin-Streptomycin雙抗(ExCell Bio公司)；DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol試劑盒(Generay公司)；Prime Script@ RTMaster Mix反轉錄試劑盒(Vazyme公司)；FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)(Roche公司)；BCA試劑盒(碧云天公司)；TMT標記試劑盒(Thermo公司)；三乙基碳酸氫銨(TEAB)(Sigma公司)；DMEM培養基(Gibco公司)；0.25% Trypsin-EDTA(Gibco公司)；FBS(批號：11G313，ExCell Bio公司)；DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；三氟乙酸(Sigma-Aldrich公司)；乙腈(Fisher Chemical公司)；二硫蘇糖醇(Sigma公司)；尿素(Sigma公司)；甲酸(Fluka公司)；碘代乙酰胺(Sigma公司)；胰酶(Promega公司)。

1.1.2 動物

BALB/c小鼠(許可證號：SCXK(京)2016-0002)，雌性，6～8周齡，體質量18±2 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司。飼養于內蒙古醫科大學動物實驗中心，SPF級鼠房，飼養溫度18～22 ℃，所有操作均符合倫理學要求。

2 方法與步驟

2.1 篩選Cr Ap抗4T1乳腺癌的作用

2.1.1 細胞生長曲線

細胞培養至細胞覆蓋率達培養瓶的80%左右，加入0.25%胰酶消化。調整細胞密度至1×104/mL，接種于24孔板中，每孔1 mL，24 h后開始計數，以后每隔24 h計數一次，計數結果取四孔平均值，連續計數6天，繪制細胞生長曲線。

2.1.2 MTT法檢測不同濃度的Cr Ap在不同時間對4T1乳腺癌細胞的抑制作用

4T1乳腺癌細胞用0.25%胰酶消化，加入培養基制成單細胞懸液，以每孔1×104接種于96孔板上，每孔100 μL，96孔板上設置空白對照組(含細胞的培養基)、不同濃度的Cr Ap給藥組(12 500、1 250、125、12.5、1.25、0.125 μg/mL)，每組設5個復孔。置入37 ℃、5% CO2培養箱中培養24～48 h，細胞貼壁后，吸除原培養液，實驗組分別加入100 μL用培養基調整后的不同濃度的Cr Ap。同時使用3塊96孔板進行上述步驟，放入37 ℃，5%CO2的恒溫細胞培養箱中，分別培養24、48、72 h。加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，避光，孵育4 h，小心地吸出每個孔內所有液體，加入150 μL DMSO，繼續避光，將96孔板放到振蕩搖床上低速震蕩10 min，上機檢測，在OD490 nm測量各孔的吸光值，抑制率=(對照組OD值-藥物組OD值)/對照組OD值×100%，進行計算。

2.2 動物分組和造模

所有BALB/c小鼠適應性喂養7天后，進行植瘤，接種4T1前用1%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液進行麻醉，腹腔注射，10 μL/g。消毒后，右腋皮下注射5×106個4T1細胞200 μL。5～7天后，小鼠腫瘤長到2～5 mm后，觸摸植瘤處可發現不規則硬塊，即代表植瘤成功。

2.2.1 動物分組

植瘤成功的BALB/c小鼠，分層分組法隨機分成：模型組、Cr Ap高、中、低劑量組，每組8只。根據臨床常用原藥量換算，結合前期動物實驗結果，給藥濃度分別為960、96、9.6 mg/kg，每日一次，連續腹腔注射給藥21天；模型組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

2.2.2 TMT定量蛋白質組學

2.2.2.1 蛋白提取

從-80 ℃取出6對樣品，將適量的瘤組織樣品稱重，置于液氮預冷的研缽中，添加液氮并充分研磨至粉末。每組樣品均加入4倍體積含8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中，超聲裂解后置高速離心機中，4 ℃，12 000 g離心10 min，小心將上清液轉移至新的離心管中，棄掉離心管底部細胞碎片，BCA試劑盒測定蛋白濃度。

2.2.2.2 胰酶酶解

將二硫蘇糖醇添加到蛋白質溶液中至終濃度為5 mmol/L，并在56 ℃下還原30 min。 然后添加碘乙酰胺，使其濃度為11 mmol/L，并在室溫避光孵育15 min。最后，將樣品的尿素濃度稀釋至2 mol/L以下。以1∶50(胰蛋白酶∶蛋白質)的質量比添加胰蛋白酶，并在37 ℃下消化過夜。稱重后繼續加入1%的胰酶，繼續酶解4 h。

2.2.2.3 TMT標記

胰酶酶解后的肽段過Strata X C18(Phenomenex)色譜柱除鹽，真空冷凍干燥。以0.5 mol/L TEAB溶解肽段，根據TMT試劑盒操作說明標記肽段。乙腈溶解并與肽段混合，室溫孵育2 h，完成標記后的肽段混合并除鹽，真空冷凍干燥待用。

2.2.2.4 HPLC分級

肽段用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。操作如下：肽段分級梯度為8%～32%乙腈、pH=9，60 min分離60個組分，隨后肽段合并為18個組分，最后各組分真空凍干備用。

2.2.2.5 液相色譜-質譜聯用分析

設置EASY-nLC 1000超高效液相系統色譜條件，流動相A：0.1%甲酸的水溶液；流動相B：0.1%甲酸的乙腈溶液。液相梯度設置：0～42 min，6%→22%B；42～54 min，22%→30%B；54～57 min，30%→80%B；57～60 min，80%B，流速：500 nL/min。 肽段用流動相A溶解進行分離， 樣品首先進入trap柱富集并除鹽，隨后通過自填裝的C18分析柱(柱子內徑150 μm，柱料粒徑3.6 μm，長度30 cm)進行分離。

通過超高效液相系統分離肽段后，注入NSI離子源進行電離。然后通過Orbitrap Fusion Lumos質譜分析。設置離子源電壓為2.4 kV，使用高分辨率Orbitrap對肽前體離子及其二級片段進行檢測和分析。一級質譜掃描范圍設置為350～1 550m/z，掃描分辨率設置為60 000；二級質譜掃描范圍則固定起點為100m/z，二級掃描分辨率設置為15 000。數據采集模式使用數據依賴型掃描程序，即在一級掃描后選擇信號強度最高的前20肽段依次進入HCD碰撞池，使用32%的碎裂能量進行碎裂，再依次進行二級質譜分析。為了提高質譜的有效利用率，自動增益控制(AGC)設置為5E4，信號閾值設置為10 000 ions/s，最大注入時間設置為60 ms，串聯質譜掃描的動態排除時間設置為30 s以避免重復掃描母離子。

2.2.2.6 數據庫搜索

二級質譜數據使用Maxquant(v1.5.2.8)進行檢索。檢索參數設置：數據庫為Mus_musculus_10090_SP_20191115(17 032條序列)，添加了反庫以計算隨機匹配造成的假陽性率，并且在數據庫中加入了常見的污染庫，用于消除鑒定結果中污染蛋白的影響；酶切方式設置為Trypsin/P；漏切位點數設為2；肽段最小長度設置為7個氨基酸殘基；肽段最大修飾數設為5；First search和Main search的一級母離子質量誤差容忍度分別設為20 ppm和5 ppm，二級碎片離子的質量誤差容忍度為0.02 Da。將半胱氨酸烷基化設置為固定修飾，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化，脫酰胺化(NQ)。定量方法設置為TMT-6 plex，蛋白鑒定、PSM鑒定的FDR都設置為1%。

2.2.2.7 質譜質控檢測

大部分肽段分布在7～20個氨基酸，符合基于trypsin酶解和HCD碎裂方式的一般規律。其中小于5個氨基酸的肽段由于產生的碎片離子過少，不能產生有效的序列鑒定。大于20個氨基酸的肽段由于質量和電荷數較高，不適合HCD的碎裂方式。質譜鑒定到的肽段長度的分布符合質控要求。

2.2.2.8 生物信息學分析軟件

分析質譜數據解析，使用MaxQuant：v.1.5.2.8 http://www.maxquant.org/；分析Motif使用MoMo： V5.0.2 http://meme-suite.org/tools/momo；GO、Domain注釋使用Inter ProScan ：v.5.14-53.0 http://www.ebi.ac.uk/interpro/；KEGG注釋使用KAAS：v.2.0 http://www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main，KEGG Mapper：V2.5 http://www.kegg.jp/kegg/ mapper.html；亞細胞定位使用Wolfpsort：v.0.2 http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html，CELLO：v.2.5 http://cello.life.nctu.edu.tw/；富集分析使用Perl module：v.1.31 https://metacpan.org/pod/Text::NSP::Measures::2D::Fisher。

2.2.3 QPCR

釆用 Trizol提取乳腺癌組織總RNA，濃度調一致后，反轉錄得cDNA。按照說明書去基因組DNA，反應條件：42 ℃ 2 min，配制20 μL反應體系，反應條件為：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。用SYBR@PrimeExTaqTW Ⅱ檢測癌組織中Ly6G、S100a8、S100a9、Tmsb4x和 GADPH的mRNA表達量，按照試劑盒說明書配制20 μL qPCR反應體系；反應過程采用兩步法，即95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃退火1 min，擴增40個循環：每個樣品6個重復；用相對表達量=2-ΔΔct公式計算各個基因的相對表達量，基因引物序列見表1。

表1 靶基因的引物序列Table 1 Primer sequences of target gene

2.3 統計學方法

在ADM/CON兩個樣本中以1.5倍變化為差異表達變化閾值，統計學檢驗采用t-test，P<0.05為顯著性閾值。富集檢驗使用Fisher’s exact test。兩個樣本中蛋白對應特異性肽段的定量值取log2(以使得數據符合正態分布)，然后用雙樣本雙尾T檢驗方法計算P。當P<0.05時，超過1.5作為顯著上調的變化閾值，小于1/1.5作為顯著下調的變化閾值。

3 結果

3.1 差異蛋白

圖1A顯示，由4T1細胞的生長曲線發現，該細胞系在鋪板3天內為對數生長期，MTT給藥選在對數生長期，可在鋪板后的1.5天給予Cr Ap明確其藥理作用。圖1B顯示，Cr Ap在體外有抗4T1乳腺癌的作用；圖1C、D顯示，造模成功，且Cr Ap能降低體內4T1乳腺癌的大小，選Cr Ap96 mg/kg作為給藥樣本與模型組進行蛋白質組學檢測。

圖1 Cr Ap對4T1乳腺癌細胞和荷瘤鼠乳腺癌組織的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of Cr Ap on 4T1 breast cancer cells and breast cancer tissues

Cr Ap/CON利用MaxQuant軟件在IPI(International Protein Index)數據庫中檢索質譜鑒定6 162個可定量蛋白，其中有15個上調的蛋白，下調蛋白僅有胸腺素β-4。具體差異蛋白的變化見表2。

表2 4T1乳腺癌中的差異表達蛋白Table 2 Differentially expressed proteins in 4T1 breast cancer

3.2 差異表達蛋白的功能分類

3.2.1 GO二級注釋分類

Cr Ap/CON的Gene Ontology(GO)分析：有7～10個差異蛋白參與調控細胞過程、單細胞生物過程、生物調節、代謝過程、對刺激的反應等生物進程(biological process)，Histone參與上述生物進程；此外，有4種差異蛋白參與免疫調控，3種差異蛋白參與細胞黏附。有14種差異蛋白參與細胞組成(cellular component)的特定成分；有10種差異蛋白參與結合活性調控(見圖2)。

圖2 差異表達蛋白在GO二級分類中統計分布圖Fig.2 Statistical distribution of differentially expressed proteins in GO secondary classification

其中Histone、Protein S100分布于細胞內外，Protein S100與免疫調節和凋亡密切相關。細胞內的差異蛋白分布在細胞核、細胞質和細胞膜中，主要位于細胞核(見表3)。

表3 差異表達蛋白的亞細胞結構定位分布表Table 3 Distribution map of the subcellular structure of differentially expressed proteins

3.2.2 COG功能分類

具有諸多生物學功能的，與Histone相關的5種差異蛋白起源于染色質結構和動力學分類；而Thymosin beta-4起源于細胞運動分類(見表4)。

表4 差異表達蛋白的COG功能分類分布圖Table 4 COG functional classification distribution map of differentially expressed proteins

3.3 差異表達蛋白功能富集分析

3.3.1 GO富集

差異蛋白Histone、Protein S100上調參與組成DNA包裝復合、核小體、蛋白-DNA復合核、染色體、端粒區域染色體、端粒區域固定膜組件等；差異上調蛋白ProteinS100參與Toll 4受體結合蛋白、 花生四烯酸結合蛋白、類二十烷酸結合蛋白、脂肪酸衍生物結合蛋白、二十碳四烯酸結合蛋白、蛋白質異二聚化活性蛋白、Toll樣受體結合蛋白、RAGE受體結合蛋白相關的分子功能。上調Histone、Protein S100參與Toll 4受體結合，參與蛋白質-DNA復合物組裝、核小體組織、染色質組裝或拆卸、DNA包裝及構象變化、白細胞聚集、基因表達的調控，表觀遺傳、白細胞與細胞的粘附、大分子甲基化、細胞氧化劑排毒、染色質組織、細胞排毒、肽分泌的調節、細胞大分子復合物組裝等生物進程(見圖3)。

圖3 Cr Ap/CON差異表達蛋白的GO富集圖Fig.3 GO enrichment map of Cr Ap/CON differentially expressed proteins

3.3.2 KEGG通路富集

差異蛋白富集于癌癥中的轉錄失調、IL-17信號通路、系統性紅斑狼瘡、產生IgA的腸道免疫網絡、哮喘、移植物抗宿主病、病毒致癌、自身免疫性甲狀腺疾病、同種異體移植排斥等通路(見圖4)。

圖4 Cr Ap/CON差異表達蛋白在KEGG通路圖Fig.4 Cr Ap/CON differentially expressed protein in KEGG pathway

3.3.3 蛋白結構域富集

上調差異蛋白結構域富集于組蛋白折疊、組蛋白H2A/H2B/H3、Ly-6抗原/uPA受體樣、S100/CaBP-9k型，鈣結合亞結構域(見圖5)。

圖5 差異表達蛋白富集的蛋白結構域圖Fig.5 Enriched protein domains of differentially expressed proteins

3.3.4 QPCR驗證結果

QPCR結果顯示Cr Ap能顯著提高乳腺癌組織中Ly6G、S100a8、S100a9的表達，顯著降低Tmsb4x基因的表達量(見圖6)。

圖6 QPCR結果Fig.6 QPCR results注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

4 討論與結論

本研究選用蛋白質組學篩選Cr Ap抗4T1乳腺癌的作用靶點，通過生物信息學分析了Cr Ap/CON的差異蛋白的主要功能、細胞定位、富集的信號通路和蛋白結構域，找到Cr Ap抗4T1乳腺癌的免疫調節作用靶點，并通過qPCR驗證Cr Ap/CON的差異蛋白的表達情況。由于文獻中選用的蛋白質組學的差異倍數為1.2倍、1.3倍、1.5倍和2倍，本實驗選用1.5倍作為差異倍數，篩選出變化差異相對較大的靶蛋白，便于后期驗證。由于Histone與乳腺癌的相關文獻報道未檢索到，因此選用除組蛋白外，差異較明顯的Ly6G、S100a9、Tmsb4x、S100a8進行驗證，在此實驗中S100a8雖然差異表達量不算太高，但其和S100a9與癌癥的發生發展密切相關。本研究發現Cr Ap在體內外均有抗4T1乳腺癌的作用，這與劉銀花研究的山慈菇水提液抑制4T1細胞增殖作用一致[6]。在TCMSP數據庫中檢索到山慈菇的化學成分有18種，依據篩選條件(OB>30%且DL>0.18)，獲得山慈菇的抗乳腺癌的3種活性成分beta-sitosterol、2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol和stigmasterol。為了明確Cr Ap作用的差異蛋白間的相關性，做了KEGG通路富集。KEGG富集通路結果顯示差異蛋白富集在IL-17信號通路和癌癥的轉錄失調信號通路。其中差異蛋白S100a8和S100a9富集于IL-17信號通路，而IL-17與Cr Ap抗乳腺癌的免疫調節作用密切相關。

文獻報道山慈菇能降低乳腺癌大鼠血清及癌組織中的VEGF和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的水平[7]；而MMP-9干擾乳腺癌細胞的侵襲及遷移，IL-17可以刺激腫瘤微環境中的各種細胞產生MMPs，促進腫瘤浸潤和轉移。IL-17F通過募集及激活CTL，下調促血管生成因子IL-6、IL-8及VEGF的表達抑制血管生成，產生抗乳腺癌免疫調節作用，本研究也檢測到山慈菇能影響癌組織中MMP含量，但差異倍數為1.2倍，因此本文中未列出。此外，IL-17F還促進腫瘤細胞分泌TNF-α，而高濃度TNF-α抑制血管形成。IL-17F募集CD8+T細胞至腫瘤組織激活NF-κB通路，從而增強抗腫瘤免疫[8]。有研究認為，IL-17F/IL-17RA缺陷小鼠，局部組織Th2淋巴細胞因子增多，通過下調Th2細胞因子抑制腫瘤進展。IL-17A募集CD4+T細胞，并促進CTL細胞的分化從而抑制腫瘤的生長[9]，由此可見，IL-17與Cr Ap抗乳腺癌的免疫調節作用密切相關。本研究發現Cr Ap/CON的差異蛋白包含多種組蛋白的變化，組蛋白與腫瘤轉錄調控(包括修飾、染色質重塑蛋白和甲基化修飾)密切相關，如轉錄后調節因子Tristetraprolin(TTP)可以負調控腫瘤的發生[10]。由此可見，癌癥中的轉錄失調通路可能是Cr Ap抗4T1乳腺癌的作用機制。已有研究發現山慈菇通過阻滯G2期細胞(與組蛋白修飾有關)而影響乳腺癌細胞生長增殖以及誘導凋亡[11]。

本研究發現Cr Ap可以降低胸腺素β-4(thymosinβ4，Tβ-4)，而Tβ-4調節缺氧/復氧經歷的癌細胞遷移和轉移[12]；且Tβ-4通過下調層粘連蛋白-5調控細胞遷移，Tβ-4可能通過誘導腫瘤血管生成，從而促進腫瘤轉移。Tβ4和Tβ10均能在體外促進小鼠乳腺癌細胞的遷移，體內促進小鼠乳腺癌的轉移，可能與上調MMP2，MMP9，Sdf1和Stat3mRNA水平有關[13]。由此可見Tβ4的下調可能是Cr Ap產生抗4T1乳腺癌的機制。Ly6G(淋巴細胞抗原6)蛋白由骨髓中髓樣來源的細胞表達，分子量約為21～25 kDa，Ly6G基因復合體與Ly6C一起組成骨髓分化抗原Gr-1。Ly6G是檢測外周中性粒細胞，單核細胞和粒細胞的標記物，Ly6G的生理作用尚不清楚，但參與抗腫瘤反應[14]。

S100-a8蛋白與ER表達水平和組織學類型有關，并與乳腺癌淋巴結轉移相關[30]。S100a9表達水平在乳腺癌血清和組織中明顯升高，在乳腺癌組織中表達明顯高于癌旁正常組織，S100/CaBP-9k屬于鈣結合蛋白，提示Cr Ap可能促使細胞內鈣含量增加。S100a8和S100a9均為S100鈣結合蛋白家族成員，研究顯示S100a8和S100a9在多種腫瘤中高表達，多種腫瘤細胞中，S100a8/a9通過雙重機制誘導細胞凋亡，由此可見S100a8和S100a9的上調可能是Cr Ap促進4T1乳腺癌細胞凋亡和產生免疫調節的主要機制。目前臨床治療TNBC的效果和預后比較差，文獻報道免疫調節治療TNBC具有相對較好的預后。機體可通過調節免疫功能產生抗TNBC作用，但腫瘤細胞可以形成特殊免疫抑制微環境逃避機體免疫系統的識別和攻擊，產生免疫逃逸[15]，然而，打破腫瘤微環境的屏障作用，便于機體免疫系統攻擊腫瘤。免疫治療TNBC已成為國際乳腺癌研究領域的新熱點[16]。也有文獻表明促進CD4+T Th2亞型向Th1亞型的轉變，也將是抗乳腺癌藥物的新作用機制[17]，本研究下一步將研究山慈菇酯提物對乳腺癌荷瘤鼠的T淋巴細胞分型和轉型的影響。因此，本研究特在小鼠體內復制TNBC模型，以期揭示Cr Ap抗TNBC的免疫作用靶點。

Cr Ap抗4T1乳腺癌的免疫調節機制與增加S100-a8、S100a9的表達，降低Tβ-4的表達相關。抗TNBC的作用機制和免疫調節作用可作為研究Cr Ap的新方向。