貯存年份對北艾和蘄艾精油成分與抑菌活性的影響研究

蔣志惠，鄭婧龍，谷令彪，李志祥，劉運革，馬立靜，王 敏，申艷紅*

1安陽工學院 河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室；2河南省亞臨界生物技術有限公司，安陽 455000

艾草(ArtemisiaargyiH.Lév.& Vaniot)是菊科蒿屬植物，多年生草本或略成半灌木狀或者小灌木狀植物。植株有濃烈香氣，莖褐色或灰黃褐色，有少數短的分枝，葉厚紙質，上面被灰白色短柔毛[1]。其全草入藥，具有溫經、去濕、散寒、止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗過敏等作用[2,3]。古籍將艾草分為北艾、蘄艾、海艾[4]。其中北艾(Beiai)主要分布于北半球溫帶、寒溫帶和亞熱帶地區，為模式標本。蘄艾(Qiai)產于湖北蘄春縣，是我國開發最早，應用最廣的艾草品種。

《孟子》云“猶七年之病，求三年之艾”。隨存放時間的延長，艾葉精油的化學成分會發生改變，精油中的醛類會發生醇化、酯化，葉綠素轉化為葉黃素使其顏色發生改變[6,7]。Jin等[5]對1、2、3年份蘄艾艾絨中精油成分進行了研究，結果發現艾絨中揮發性成分的相對含量隨著貯存時間的增加而降低，且陳年艾中以大分子揮發性成分為主。灸療時燃點附近的精油揮發至燃燒部位，產生短時高溫，而后精油含量減少，溫度下降。陳艾精油含量較低，灸療時火力溫和，可在一定程度上闡明艾灸時用3年陳艾效果最佳的原因。但到目前為止貯存年份對于艾葉精油化學成分的影響尚不明確。此外，研究表明艾草具有抑菌作用[8-10]，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌均具有顯著的抑制作用[11,12]，但艾草貯存年份導致化學成分的改變是否影響其抑菌作用亦不明確。故本研究選取3個貯存年份的北艾和蘄艾，通過比較精油提取率和GC-MS/MS分析結果，明確不同貯存年份和不同品種艾葉精油含量與成分的差異；并通過抗菌譜篩選和最小殺菌濃度測定，分析不同貯存年份和不同品種艾葉精油抑菌能力的差異，以期為艾草資源的科學貯存與合理化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年5月份采集的新鮮北艾(河南省安陽市湯陰縣扁鵲廟內，坐標114.435 159°35.87 178′N)和蘄艾(湖北省黃岡市蘄春縣，坐標115.365 152°30.048 862′N)，在同一貯存條件下分別存儲0年、1年和2年。貯存條件依據艾草貯存行業標準：置于清潔、陰涼、干燥、通風的庫房內，樣品堆放處距離熱源2 m以上，室溫(10～30 ℃)，周圍空氣無酸性或其他有害氣體，無易燃易爆物品。

供試菌種：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌耐藥菌(Staphylococcusaureusresistant bacteria)、大腸桿菌耐藥菌(Escherichiacoliresistant bacteria)、沙門菌耐藥菌(Salmonellaresistant bacteria)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)均由國家重點微生物資源實驗室提供，大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由西北農林科技大學微生物實驗室提供。

儀器：精油提取分離器(常州榮華漢器制道有限公司HDM-2 000D)；恒溫培養箱(海智城分析儀器制造有限公司ZXGP-A2 160)；高壓滅菌鍋(華粵企業集團有限公司華粵行儀器有限公司HVA-110)；氣相色譜與質譜聯用儀(安捷倫科技有限公司5 977A-MSD)。

1.2 試驗方法

1.2.1 水蒸汽蒸餾法提取艾葉精油

艾草前處理：將自然晾干后的艾葉粉碎，過80目篩，放入自封袋中備用。

稱取60 g艾葉粉放入三口燒瓶，加入600 mL蒸餾水和4顆沸石，放入精油分離器中，95 ℃加熱2 h收集下層的艾露和上層精油。

1.2.2 艾葉精油提取得率的計算

艾葉精油提取得率=M1/M2×100%

M1：艾葉精油重量；M2：艾葉粉質量。

1.2.3 GC-MS測定條件

5 977A-MSD氣相色譜條件為：HP-5 ms(非極性毛細管柱，30 m×250 μm×0.25 μm，載氣為氦氣，流量：10 mL/min)初始溫度70 ℃，采用程序升溫以10 ℃/min速率升溫至95 ℃。再以5 ℃/min速率升溫到125 ℃，以6 ℃/min速率升溫到180 ℃，以20 ℃/min速率升溫到280 ℃，進樣量2 μL，分流比15∶1。

質譜分析條件為：離子源為EI，電離電壓70 eV，進樣口溫度200 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30～600 amu[13]。

1.2.4 藥敏片法測定抗菌譜

根據菌種配制相應的培養基，高壓滅菌后以每個平板10 mL的體積制成固體培養基，每個平板劃分為四個區域，每區分別加入15 μL不同的菌懸液，等待10 min，用無菌鑷子將直徑為0.6 mm，且浸泡5 μL艾葉精油24 h的藥敏片分別放入四個區域中央。放入37 ℃恒溫培養箱中培養12 h后，測量抑菌圈直徑。以頭孢唑啉為陽性對照。

1.2.5 最小殺菌濃度(MBC)測定

制作濃度為20%的艾葉精油稀釋液，將濃度為10 000 CFU/mL對數生長期的菌懸液同艾葉精油稀釋液混合培養12 h。取以上培養菌液，接種到LB固體培養基上，在37 ℃培養箱中培養12 h，觀察平板。若無菌落生長則將艾葉精油濃度降低10%，若有菌落生長則將艾葉精油濃度增加10%，重復以上步驟。不生長菌落的最小濃度即為菌種的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結果與討論

2.1 貯存時間影響艾葉精油提取率

結果如表1所示，隨著貯存時間的增加，艾葉精油的提取率下降。存儲0年、1年和2年份的北艾和蘄艾精油提取率無顯著性差異(P>0.05)，但蘄艾的精油平均提取率高于北艾。

表1 不同貯存時間和品種艾葉精油提取得率Table 1 Effect of different storage time and species of Artemisia on yield of essential oil

2.2 不同貯存時間和艾草品種影響艾葉精油的化學成分

不同品種、不同年份的艾葉精油具有不同的顏色(圖1A)。北艾精油2年份、1年份和0年份的顏色分別為淺黃色(a)、黃綠色(b)、綠色(c)。蘄艾精油0年份、1年份和2年份的顏色分別為淺綠色(d)、藍綠色(e)、藍色(f)，提示不同貯存年份和品種的艾葉精油化學成分可能存在差異。

采用GC-MS法檢測了3個貯存年份的北艾和蘄艾精油化學成分。通過出峰時間和峰面積發現3個貯存年份的北艾和蘄艾精油化學成分和相對含量存在顯著差異，圖1D、F 中提示0年份和1年份北艾精油中小分子揮發性物質較多，隨著貯存年份的增加，大分子揮發性物質隨之增加。

成分鑒定表明不同貯存年份和品種的艾葉精油化學成分存在差異性。0年份、1年份、2年份的北艾和蘄艾分別有9種、14種、17種相同成分(圖2)。與北艾相比，側柏酮為蘄艾的特有成分(thujone，圖1C 6.124 min，圖1E 6.866 min和圖1G 6.862 min)。三個存儲年份北艾精油之間有16種相同成分，其中主要成分桉油精(eucalyptol)和龍腦(borneol)含量隨貯存年份的增加而減少。2年份艾葉精油獨有植醇正十四碳烷(tetradecane)，且含量較高(19.99%)。3個存儲年份蘄艾精油之間有20種相同成分(圖2F)，其中側柏酮和醋酸冰片酯(bornyl acetate，圖1C 11.448 min，圖1E 11.428 min，圖1G 11.426 min)的含量隨著貯存年份的增加而降低。

圖1 不同貯存年份北艾和蘄艾精油顏色及其氣相色譜圖譜

不同貯存年份和品種艾葉精油中萜類成分占比最多，其次是生物堿。隨著貯存年份的增加，隨之降低(圖2G)。通過分析前5種主要的化學成分發現(表2)，不同貯存年份和品種的艾葉精油存在相同成分，3個貯存年份的北艾和蘄艾均含有eucalyptol(桉油精)；0年份和1年份北艾含有2,4,6-trifluoroaniline(三氯苯胺)和3,3,5,5-tetramethyl-6-(2,4,6-trimethyl-benzoyl)-dihydro-pyran-2,4-dione；0年份北艾和1年份蘄艾含有benzoic acid 2,4,6-trimethyl-2,4,6-trimethylphenyl ester；1年份北艾和蘄艾含有benzoic acid,4-propyl-,4-cyano-3-fluorophenyl ester和ethanone,1-[4-(1-methylethyl)phenyl]-；2年份北艾和蘄艾含有caryophyllene oxide(石竹烯氧化物)。

續表2(Continued Tab.2)

2.3 不同貯存年份和品種精油的抗菌譜比較

如圖3所示，艾葉精油的抗菌譜較廣。從貯存年份上分析，0年份的艾葉精油抗菌譜廣、抑菌圈直徑長。從品種上分析，北艾精油的抗菌譜較蘄艾精油更廣。其中0年份的北艾精油抗菌譜廣泛，對沙門菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌耐藥菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌具有顯著的抑制作用，但對李斯特菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌和金黃色葡萄球菌無顯著抑制作用。0年份蘄艾精油可有效抑制沙門菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌耐藥菌、綠膿桿菌和大腸桿菌。1年份蘄艾和北艾精油抑菌圈大小與陽性對照無顯著性差異。而2年份北艾和蘄艾精油抗菌譜較窄，對沙門菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌無抑菌效果。

圖3 艾葉精油抑菌圈大小Fig.3 Diameter of bacteriostatic zone of different Artemisia species in different storage years (mm)

2.4 不同貯存年份和品種精油的最小殺菌濃度比較

如表3所示，不同品種和貯存年份的艾葉精油的殺菌能力存在差異。整體分析發現，存儲時間越短，殺菌能力越強，但金黃色葡萄球菌除外。從品種分析，與0年份蘄艾精油相比，0年份北艾精油對枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、大腸桿菌耐藥菌、沙門菌耐藥菌和綠膿桿菌的最小殺菌濃度較低，說明殺菌能力較高。

表3 艾葉精油對供試菌種的最小殺菌濃度Table 3 MBC of different species Artemisia in different storage years

3 討論

艾草較其他植物性藥材相比，具有貯存年份的特殊性。艾草跟據貯存時間分為0年艾、1年艾、2年艾等。研究表明，艾草不同貯存時間影響其藥性，然而具體原因仍不清楚。因此我們選取《本草綱目》中記載的主要品種北艾和蘄艾作為品種的研究對象，以0年、1年和2年貯存時間為研究時限，比較不同年份和品種艾葉精油中的物理性質、化學成分和種類、抑菌能力，進而解析貯存時間對艾葉精油化學成分和抑菌能力的影響。

首先，貯存時間影響艾葉精油的化學成分。比較艾葉精油的提取率發現，艾葉精油的含量隨著貯存時間的增加而降低。預實驗期同樣提取了貯存3年的艾葉精油，提取率為0.06%，由于精油含量較低，我們選取0年、1年和2年貯存時間為研究時限。從不同貯存年份的同種艾葉精油比較發現，3個貯存年份的北艾精油共同具有的次生代謝產物有16種，蘄艾有20種，分別占總產物的12.8%、31.2%，表明次生代謝產物的變化受存儲年份的影響。其中，生物堿類的占比整體變化較小，萜類占比隨著貯存年份的增加而降低，酯類變化占比無規律，該結果與葉羊等研究結果相似[14]。艾葉精油為揮發性成分，可因與空氣和光線接觸發生氧化變質、水解反應和重排現象，使其成分相對比重增加，顏色加深[6,7]。我們的研究結果也發現艾葉精油的顏色隨著貯存年份的增加而不同，北艾精油分別為綠色、黃綠色、淺黃色，蘄艾精油分別為淺綠色、藍綠色、藍色，且隨著存儲年份的增加，小分子的揮發性物質相對含量降低，大分子的揮發物質相對含量增加。

3個年份的北艾和蘄艾精油均含有1，8-桉油精、樟腦和龍腦，且含量較高。我們前期研究結果發現1，8-桉油精具有抑菌、消炎、抗氧化的作用[15]。龍腦也叫天然冰片，是一種珍貴的醫藥原料、高級香料和化學原料，在中國和印度被用于食品和民間醫藥中，具有抗炎和神經保護的作用[16]。樟腦具有驅蟲[17]、殺蟲、消炎的作用，被廣泛地用作化妝品的香味劑、食品的調味劑、家庭清潔劑的常見成分，以及局部應用的止痛劑和治療輕微肌肉疼痛的發紅劑。因此不同品種、貯存時間的艾葉精油具有抗菌、消炎、驅蟲等功效，但其藥理學活性也存在著雙面性，大劑量的樟腦具有神經毒性[17]。分析結果發現，三個貯存年份的蘄艾均含有側柏酮，而北艾未檢測出該成分。研究表明側柏酮除了具有抑菌作用，還具有較強的神經毒性，因此蘄艾精油作為藥物、食品等添加劑的安全性還需要進行評價。

其次，貯存時間影響艾葉精油的抑菌活性?；诨瘜W成分的不同，我們推測貯存年份的不同，其抑菌活性不同。從結果中比較發現，3個存儲年份的北艾和蘄艾精油均具有較好的抗菌譜和抑菌活性，與其他年份相比，0年份北艾和蘄艾精油的抗菌譜最廣，最小殺菌濃度較低。抑菌活性的改變可能與萜類含量有關。研究表明萜類具有抑菌、殺菌的活性，它可以破壞細胞膜的滲透性[18]，導致核酸等大分子物質的外泄，同時對細胞菌體蛋白的合成和積累有干擾作用。并且萜烯相互作用可誘導細胞呼吸的改變，隨后導致微生物氧化磷酸化的解耦聯[19]，對耐藥菌具有協同抑制的作用，因此，67%的增效劑都屬于單萜類和倍半萜類[20]。本實驗結果表明艾葉精油中的萜類化合物種類較多，且隨著貯存年份的增加而降低。我們通過比較發現，0年份的eucalyptol(桉油精)、β-mycrene(β-月桂烯)、bicylo[3.1.1]heptane,6,6-dimethyl-3-methylene含量較多。研究表明桉油精、月桂烯具有較強的抑菌能力，推測艾葉精油抑菌活性的主要成分為桉油精和月桂烯。與0年份的蘄艾精油相比，北艾精油對枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、大腸桿菌耐藥菌、沙門菌耐藥菌和綠膿桿菌的最小殺菌濃度較低，對金黃色葡萄球菌、沙門菌的最小殺菌濃度較高。說明不同品種艾葉精油對不同細菌的殺菌能力不同，可以有針對性的選擇品種使用。

本研究發現不同貯存年份和品種的艾葉精油其化學成分和抑菌活性也存在差異。貯存年份主要影響萜類和酯類的含量比例。與北艾的化學成分相比，蘄艾含有特有成分側柏酮。另外，0年份的艾葉精油具有較廣的抗菌譜，較低的最小殺菌濃度，推測主要的殺菌活性成分為桉油精和龍腦。綜上結果，不同存儲年份的北艾和蘄艾化學成分與抑菌活性具有較大的差異性，因此艾葉應用在醫療、食品等方面應重新評價不同年份和品種的化學成分及功能。

綜上，艾葉精油含量隨著貯存年份的增加而降低，且艾葉精油中的化學成分發生變化。其中生物堿類的占比整體變化較小，萜類占比隨著貯存年份的增加而降低，酯類變化占比無規律。艾葉精油的抗菌譜較廣，從貯存年份上分析，0年份的艾葉精油抗菌譜廣。從品種上分析，北艾精油抑菌效果較蘄艾顯著。從化學成分上分析，蘄艾精油因含有側柏酮存在潛在的神經毒性。