基于網絡藥理學及分子對接的浙貝母花-枇杷花藥對止咳化痰作用機制研究

崔明超，王翰華，陳少軍

1浙江醫藥高等?？茖W校，寧波 315100；2南京中醫藥大學，南京 210046

“貝枇雙花飲”為課題組開發的保健飲料，可用于咳嗽類疾病的輔助治療[1]，其主要組成為浙貝母花和白枇杷花。浙貝母花(Fritillariae Thunbergii Flos，FTF)為百合科植物浙貝母FritillariathunbergiiMiq.干燥帶花梗的花[2]，主要含有生物堿、黃酮、揮發油等成分[3]；枇杷花(Eriobotryae Flos，EF)為薔薇科枇杷屬植物枇杷EriobotryajaponicaLindl.的干燥的花，主要含有三萜類、黃酮類、揮發油等[4]，兩者均具有止咳化痰的作用。實驗證明，浙貝母花與枇杷花配伍有較好的止咳、化痰[5]、抗菌、抗炎[6]作用，課題組在“貝枇雙花飲”保健飲品的開發中發現，發現浙貝母花與枇杷花水提物1∶4配伍使用(3 g/kg，灌胃)具有顯著的止咳、化痰作用(小鼠氨水引咳模型、豚鼠枸櫞酸引咳模型和小鼠氣管酚紅排泌模型)，其效果明顯優于同等劑量單味藥物，證明兩者具有協同作用，可增強止咳化痰療效[5]。

本文采用網絡藥理學結合分子對接的研究方法，以浙貝母花—枇杷花藥對的活性成分為研究對象，通過建立“成分—靶點—通路”網絡，以闡釋其止咳化痰作用的機制。

1 材料和方法

1.1 化學成分收集與活性成分篩選

課題組前期獲得的浙貝母花成分211個，枇杷花中成分127個，借助TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)平臺，以口服生物利用度(oal bioavailability，OB)和類藥性(drug-like，DL)評價成分的體內過程，以OB≥30%和DL≥0.18作為活性成分篩選條件，同時參考相關文獻，以獲得活性成分。

1.2 藥物靶標的獲取

靶標的獲取采用Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據平臺，獲取化合物的作用靶點。

1.3 疾病靶點的篩選

結合前期研究匯中貝枇雙花飲具有止咳、化痰的藥理作用，選擇關鍵詞為“cough，phlegm”，在GenCLiP 3(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)和Drugbank(https://www.drugbank.ca/)中檢索并得到相關基因。GenCLiP 3是基于PubMed數據庫搜索與疾病相關基因的文本挖掘平臺，而Drugbank是整合了生物信息學學資源，特別是已被驗證的藥物靶點信息的數據庫。

將以上不同來源的靶標在UniProt(http://www.uniprot.org/)數據庫統一名稱，并刪除重復和錯誤的靶標。

將篩選到的藥物作用靶點和止咳化痰靶點上傳至在線韋恩圖(venn diagram http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/)，得到交集，以確定藥物與疾病的共同作用靶點。

1.4 成分—靶點網絡構建和分析

為了進一步了解浙貝母花—枇杷花靶點和疾病靶點在蛋白水平上的作用機制，利用在線網站STRING(https://string-db.org)獲取蛋白質相互作用網絡圖(protein-protein interaction network，PPI)，旨在從生物化學、信號轉導和遺傳網絡等不同角度研究化合物和疾病相關蛋白質分子之間的相關性。然后，使用生物信息學可視化軟件Cytoscape 3.7.1構建“化合物—靶點”互作網絡圖；網絡分析中重點關注的是其中的度值(degree)和中介中心度(betweenness centrality)。

1.5 GO功能富集分析和KEGG代謝通路注釋分析

為了進一步研究獲得靶標的功能注釋，利用Cytoscape中ClueGO和CluePedia插件，選擇物種為智人(Homo sapiens)，進行GO功能富集分析和KEGG代謝通路注釋分析(P≤0.05)。

1.6 分子對接

從PDB蛋白質數據庫中(https://www.rcsb.org/)下載蛋白質結構的pdb格式，Drugbank中檢索相關靶點的已知藥物作為陽性藥物，在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載相關分子的SDF結構，利用Chemoffice中Chem 3D組件進行MMFF94能量最小化，利用Openbabel(https://sourceforge.net/projects/openbabel/files/openbabel/2.4.1/)用于格式轉換，采用AutoDock Vina 1.1.2(Molecular Graphics Lab，http://vina.scripps.edu/)進行分子對接并打分。利用Discovery Studio Visualizer 2020對復合物進行受體蛋白與配體小分子的相互作用分析。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選

在前期化學成分分析及文獻研究的基礎上，共從浙貝母花中收集了211個化合物，從枇杷花中收集了128個成分，然后將其中OB≥30%和DL≥0.18的化合物篩選出來；同時，為了彌補虛擬篩選的不足，結合文獻檢索結果，一些藥代動力學性質相對較差，但有相關文獻報道活性較好的成分也被納入候選活性成分進一步研究。最終，共得到20個化合物作為候選活性分子，其中浙貝母花成分11個(編號1～11)，枇杷花成分11個(編號11～20)，共有成分2個(編號10、11)，包括了生物堿、三萜、黃酮、植物甾醇、脂肪油等多類化學成分(見表1)。

表1 浙貝母花—枇杷花中潛在活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of potential active compounds in FTF and EF

2.2 化合物及疾病靶點的篩選

通過GenCLiP 3和Drugbank數據庫檢索，分別得到與咳嗽、痰相關的基因365個、130個。通過Swiss Target Prediction，分別預測了浙貝母花、枇杷花中成分作用靶點61個、117個。通過在線韋恩圖獲得集合基因為42個，納入研究對象(見圖1)。

圖1 靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets

2.3 成分—靶點網絡的構建及分析

通過STRING和Cytoscape構建了成分—靶點互作圖。其中，菱形節點表示靶點，圓形節點表示成分，邊表示成分與靶點、靶點與靶點之間的相互作用。

在互作網絡中(圖2)，作用靶點PTGS2、AKT1、VEGFA、TNF等是其中的關鍵基因(見表2)。而山柰酚、貝母素乙、異鼠李素、槲皮素等藥物成分可能網絡中的關鍵成分(見表3)。

圖2 成分—靶點互作網絡圖Fig.2 Component-target interaction network注：菱形圖示表示靶點；圓形圖示表示成分；圖示顏色越接近紅色則表示度值越高。Note:Diamond represents targets;Ellipse represents components;Light color represents high degree.

表2 網絡關鍵靶點的基本信息Table 2 Basic information of key targets in FTF and EF

表3 網絡關鍵成分的基本信息Table 3 Basic information of key compounds in FTF and EF

2.4 GO富集分析和KEGG通路注釋分析

GO功能富集分析表明，藥物可通過調節對外來刺激的反應(GO:9410)、認知(GO:50890)、調節炎癥反應(GO:50727)等發揮止咳化痰作用(見圖3和表4)。其中，在統計學中，隨著檢驗次數的增加，錯誤拒絕原假設的概率即I型錯誤率大大增加。Bonferroni校正是統計學上減少I類錯誤的方法，因此采用Bonferroni校正P值作為主要參考依據。

圖3 GO功能富集分析圖Fig.3 GO functional enrichment analysis

表4 GO功能富集分析Table 4 GO functional enrichment analysis

KEGG通路富集分析表明，脂肪細胞脂解調節(regulation of lipolysis in adipocytes)、VEGF(VEGF signaling pathway)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)等信號通路可能是藥物發揮作用的重要通路(見圖4和表5)。

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis

表5 KEGG 通路富集分析Table 5 KEGG pathway enrichment analysis

2.5 分子對接

采用Autodock Vina等軟件將浙貝母花—枇杷花藥對中的20個成分分別與互作網絡中的4個關鍵靶點PTGS2(PDB ID：5F1A)、AKT1(PDB ID：4EJN)、VEGFA(PDB ID：4KZN)、TNF(PDB ID：2AZ5 )進行對接并打分(單位為kcal/mol)。根據Drugbank檢索結果，以前列腺素E2(CID：5280360)、前列環素(CID：5282411)作為PTGS2(PDB ID：5F1A)的陽性對照藥物，妥布霉素(CID：36294)、利多卡因(CID：3676 )作為AKT1(PDB ID：4EJN)的陽性對照藥物，尿囊素(CID：204)、左薄荷腦(CID：16666)作為VEGFA(PDB ID：4KZN)的藥性對照藥物，氮卓斯汀(CID：2267)、泊馬度胺(CID：134780)作為TNF(PDB ID：2AZ5)的陽性對照藥物。

由表6可知，貝母素乙、貝母素甲、科羅索酸、2α-羥基烏蘇酸、熊果酸、槲皮苷等對4個靶點的親和力較強。

表6 分子對接結果Table 6 Scores of molecular docking

續表6(Continued Tab.6)

以與靶點結合較好的幾個成分為例，進行受體—配體相互作用分析。對貝母素甲和PTGS2、貝母素乙和AKT1、齊墩果酸和VEGFA、科羅索酸和TNF的對接情況分析，結果表明受體蛋白與小分子配體之間主要是氫鍵、Pi-Sigma、烷基和Pi-烷基等作用(見圖5)。

圖5 蛋白及其配體的相互作用圖Fig.5 Interaction of proteins and ligands注：A：貝母素甲和PTGS2；B：貝母素乙和AKT1；C：齊墩果酸和VEGFA；D：科羅索酸和TNF。Note:A:Peimine and PTGS2;B:Peiminine and AKT1;C:Oleanolie acid and VEGFA;D:Corosolic acid and TNF.

3 結論

中醫藥中“止咳化痰”是一個比較廣泛的概念，本文中只對其中狹義的鎮咳作用和化痰相關藥理作用進行研究。本研究采用網絡藥理學的方法，對浙貝母花—枇杷花止咳化痰的作用機制進行了探討，兩者共有20個活性成分，作用于42個靶點，可以映射到14條代謝通路中。從成分—靶點的互作網絡分析，浙貝母花與枇杷花兩者均富含的黃酮類成分可能是其主要活性成分，如槲皮素、山柰酚、異鼠李素被證明是紅旱蓮、貓眼草、紅管藥、雞素苔、矮地茶等具有止咳化痰中草藥的活性成分，有著止咳、祛痰、平喘等多種藥理作用[7]。而從分子對接的結果來看，浙貝母花中的生物堿類成分和枇杷花中的三萜類成分也起到了重要作用。貝母素甲和貝母素乙的具有很好的鎮咳作用[8]。烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸具有止咳和抗炎作用[9]。不同成分可對同一靶點或同一信號通路的上下游基因共同產生作用，推測可能是其配伍使用增強療效的機制之一。

從網絡中的主要作用靶點分析，PTGS2可以將花生四烯酸轉化為前列腺素H2(PGH2)，與氣道炎癥密切相關[10]。AKT1抑制AKT磷酸化可以減弱人支氣管平滑肌增殖，以減輕氣道重塑[11]。MUC5AC是哮喘中過量產生的主要粘蛋白糖蛋白，而VEGF可以上調MUC5AC，與哮喘患者的炎癥和氣道血管重塑有關[12]。TNF-α與氣道炎癥及皮質類固醇耐藥密切相關[13]。通過通路富集分析發現，主要涉及的是炎癥免疫相關通路，主要是抑制氣道炎癥，如花生四烯酸代謝、白介素-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路[14]；影響氣道重塑和黏液分泌過多，如VEGF信號通路[15]。浙貝母花—枇杷花中成分與關鍵靶點PTGS2、AKT1、VEGFA、TNF分子對接結果部分驗證了網絡藥理學的預測，說明其中的生物堿類、三萜類、黃酮類成分是藥對中的主要藥效成分。

綜上所述，浙貝母花—枇杷花藥對止咳化痰的主要機制為作用于VEGF、花生四烯酸代謝、白介素-17、腫瘤壞死因子等信號通路，作用于PTGS2、AKT1、VEGFA、TNF等靶點；從而抑制呼吸道炎癥，減少黏液分泌，抑制氣道重塑，產生止咳化痰的作用。本文僅從網絡預測，未考慮到各成分的含量及在合用時成分之間的變化，結果仍需進一步的驗證。