基于網絡藥理學的四君子湯治療阿爾茨海默病作用機制研究

張運輝，周小青，伍大華，楊夢琳，鄭彩杏，童天昊

1湖南中醫藥大學；22011數字中醫藥協同創新，長沙 410208；3重慶三峽醫藥高等專科學校中醫學院，重慶 404120；4湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410006

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見的癡呆類型，起病潛隱，以嚴重的認知和記憶功能減退，并伴有進行性的智能、記憶、言語、視空間技能障礙及精神人格改變等主要表現的神經系統退行性病變[1]。目前，西醫對AD病因及發病機制仍未完全闡明，尚無根治AD的藥物，成為公共健康和醫療界的挑戰之一[2]。我國傳統中醫通過辨病與辨證相結合，抓住AD病因病機特點，隨證加減用藥，在改善AD患者學習記憶等認知功能、提高生活和社會交往能力方面具有較確切的療效[3]。

Song[4]認為，脾胃為后天之本，氣血生化之源。年老體邁者，脾胃虛弱，水谷精微不能化為精血，腎精空虛，腦髓失充則發為癡呆之證。Lu[5]認為脾胃虛弱是AD的根本原因，由虛而致痰濁血瘀，痰瘀阻塞清竅，加速AD形成。提出“從脾胃論治”AD，并發現健脾方藥對AD有一定的治療作用。四君子湯是經典補脾方藥，始載于《太平惠民和劑局方》，由人參、白術、茯苓、甘草組成。其中人參性甘溫，益氣補脾，為君；白術苦溫，健脾燥濕，合人參以益氣健脾，為臣;茯苓甘淡，滲濕健脾，為佐；炙甘草甘平，和中益土，為使。四味皆為平和之品，四藥相輔，共奏益氣健脾之功，為治脾胃氣虛的基本方。實驗研究表明，四君子湯水提液能提高Aβ25-35誘導的HBMEC損傷細胞的活性，調控GLUT1、LRP1、RAGE mRNA和LRP1蛋白、RAGE蛋白的表達，有助于Aβ跨血腦屏障轉運，減少Aβ在腦內的聚集[6]；四君子湯可能通過補脾作用，促進AD大鼠中樞能量生成，改善中樞的能量代謝紊亂，調節線粒體復合體活性及AMPK表達[7]。臨床研究發現[8]，四君子湯合黃連解毒湯治療阿爾茨海默病療效顯著。因此，深入探討四君子湯的作用靶點及相關信號通路，分析其對AD的影響及其作用機制，對于闡述四君子湯治療AD的科學內涵以及為AD的臨床治療提供有價值的信息。

由于生物信息學的迅速發展，網絡藥理學方法已成為一種系統、高效地揭示中藥復方分子機制的新手段。網絡藥理學主要研究藥物、靶標和疾病之間的關系，可通過整合中藥化學成分、疾病靶標構建“化學成分-作用靶標-疾病靶標-蛋白質相互作用網絡”，將相互作用關系可視化為網絡模型，并從分子層面和整體的角度研究藥物對生物網絡的影響[9]，其研究策略的系統性、整體性特點與中醫基礎理論從整體觀念、辨證論治的角度去診治疾病的理念，中藥及方劑的多成分、多靶點、多途徑協同作用的原理非常契合[10]。因此，本研究借助網絡藥理學方法，探討四君子湯治療AD的可能作用機制，以期為四君子湯的深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 四君子湯有效成分及其靶點的篩選

以“人參”、“白術”、“茯苓”、“甘草”為關鍵詞，從TCMSP數據庫(中藥系統藥理學分析平臺，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查詢人參、白術、茯苓、甘草四味中藥的有效成分，本研究基于ADME(藥物吸收、分布、代謝、排泄)參數進行篩選，對人參、白術、茯苓、甘草的有效成分根據口服利用度(oral bioavailability OB)和類藥性(drug- like，DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對應靶點，并設置OB≥30%及DL≥0.18作為篩選條件[11]，篩選出人參、白術、茯苓、甘草的有效成分。通過篩選，559個化合物分子中有136個符合條件，并將其作為候選化合物。為了提供更準確的結果，本研究只選擇TCMSP數據庫中OB≥33%及DL≥0.19作為有效成分，一共篩選出24個活性化合物。最后，使用Uniprot 數據庫并借助Perl 語言，將靶點的“蛋白名(protein name)”統一轉換為“基因名(genename)”，得到的信息用于后續的網絡藥理學數據分析。

1.2 AD疾病相關基因的篩選

通過治療靶點數據庫Drugbank (https://www.drugbank.ca/)、Dis Ge NET(http:// www.disgenet.org/)和TTD(https://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)對AD相關的基因進行篩選，將四君子湯預測的相關靶點網絡映射到AD相關靶點網絡中，2個網絡中重疊的基因即被認為是四君子湯中藥成分治療AD的作用靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

將四君子湯預測的相關靶點網絡映射到AD相關靶點網絡中，2個網絡中交集基因即被認為是四君子湯中藥成分治療AD的作用靶點。將四君子湯有效成分與AD的交集基因導入到STRING數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”(人源)進行操作，最小相互作用閥值設為“medium confidence=0.4”，得到蛋白互作PPI網絡，即“四君子湯-靶點-阿爾茨海默病”網絡。

1.4 關鍵靶點的篩選

應用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網絡進行拓撲屬性分析，計算PPI網絡整體的中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和點度中心性(degree centrality，DC)，以betweenness、closeness和degree的均數為“閾值”，選取betweenness、closeness和degree同時在閾值之上的靶點為“關鍵靶點”，明確PPI網絡中的關鍵靶點。

1.5 關鍵靶點的代謝通路與生物過程分析

為進一步研究四君子湯抗AD的作用情況，采用Metascape平臺對四君子湯的AD靶點群進行KEGG代謝通路富集分析，研究四君子湯靶點的主要抗AD代謝通路；再進行GO生物過程富集分析，詮釋四君子湯靶點的抗AD生物過程，Metascape的平臺列表與背景均選擇“Homo Sapiens”(人源)進行操作。篩選出AD與四君子湯有效成分相關性前20的分子功能和前10的信號通路。

1.6 網絡構建

將四君子湯有效成分、對應靶點導入Cytoscape3.7.1構建四君子湯-有效成分-基因靶點網絡。

1.7 體外驗證實驗

1.7.1 細胞與試劑

大鼠腎上腺髓質嗜絡細胞瘤細胞株PC12細胞(長沙贏潤生物技術有限公司)；Aβ25-35(購自美國Sigma公司)；TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒(TAKARA公司)；DMEM細胞培養液(北京默飛世爾生物化學制品有限公司)；10%新生小牛血清(Hyclone Lab)；PBS(北京索萊寶科技有限公司)；FBS(吉泰遠成生物科技有限公司)。四君子湯1劑購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，經水提、蒸發、濃縮至不流動的清膏，使用時稱取適量，溶解，過 0.22 μm 濾膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2 細胞培養及分組干預

PC12細胞培養于DMEM培養基(含10%FBS、1%PBS)，37 ℃、5%CO2培養箱培養，細胞貼壁后取對數生長期細胞，分為5組。對照組：加入不含FBS、PBS DMEM中孵育24 h；模型組：予Aβ25-35(20 μmol/L)孵育24 h[12]；四君子湯低劑量組(1 mg/mL)、中劑量組(2 mg/mL)、高劑量組(4 mg/mL)孵育24 h。

1.7.3 QPCR檢測PC12細胞培養上清APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAOB、INSR mRNA表達

Trizol法提取PC12細胞總mRNA，逆轉錄合成c DNA。使用Primer-BLAST設計引物序列(見表1)。反應條件為95 ℃ 3 min→95 ℃ 5 s → 60 ℃ 1 min，重復40個循環；按95 ℃ 15 s→55 ℃ 1 min→95 ℃ 30 s反應條件測溶解曲線。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法分析基因表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7.4 統計學處理

2 結果

2.1 四君子湯有效成分的篩選和靶標預測及分析

為了提供更準確的結果，本研究選擇TCMSP數據庫中OB≥33%及DL≥0.19作為有效成分，一共篩選出24個活性化合物(如表2)。其中人參有效成分9個、白術有效成分3個、茯苓有效成分6個、甘草有效成分6個。其中人參皂苷Rh2、人參二醇、茯苓多糖、異甘草素等在活性成分中占主要比例。對四君子湯候選靶標進行基因分析，取P值排名前 20位，得到候選靶標的基因功能，涉及抗凋亡、抗炎、對β淀粉樣蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)的反應、對氧化應激反應的調節、對自噬的調控、老化、記憶、對胰島素的反應、氧化還原過程等。對四君子湯候選靶標進行通路富集分析，取P值排名前20位，得到候選靶標參與的通路信息，主要涉及凋亡、阿爾茨海默病、炎癥反應、自噬、胰島素代謝等通路。

表2 四君子湯有效成分Table 2 Effective ingredients of Sijunzi Decoction

2.2 有效成分-基因靶點網絡的構建

將篩選后四君子湯的28個有效成分及166個相關靶點導入 Cytoscape 3.7.1構建“四君子湯有效成分-基因靶點網絡”(見圖1)。24個菱形表示四君子湯的有效成分，164個綠色三角形為有效成分作用靶點，共有898條邊代表靶點和有效成分之間的相互作用，體現了四君子湯多成分、多靶點的特點。

圖1 四君子湯有效成分-基因靶點網絡Fig.1 Effective ingredients of Sijunzi Decoction-gene target network注：藍色菱形：人參活性成分；紅色菱形：白術活性成分；黃色菱形：茯苓活性成分；紫色菱形：甘草活性成分；綠色三角：靶基因。Note:Blue diamond:Active compound of Ginseng Radix et Rhizoma;Red diamond:Active compound of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma;Yellow diamond:Active compound of Poria cocos;Purple diamond:Active compound of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Green triangle:Target gene.

2.3 阿爾茨海默病相關基因

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD數據庫檢索AD的靶基因，去重后共得到2 245個基因。

2.4 蛋白互作網絡構建圖

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD數據庫檢索AD的靶基因與四君子湯作用的靶基因有102個重復，這102個靶基因可能為四君子湯抗AD的靶點。為研究各靶點在體內的相互作用關系，尋找核靶點，將潛在靶點蛋白群進行PPI網絡分析(見圖2)，結果共發現102個靶蛋白發生相互作用，產生722條代表蛋白之間相互作用的邊。其中疾病靶標主要有PSEN1(早老素1)、PSEN2(早老素2)、APOE(載脂蛋白E)、APP(淀粉樣β前體蛋白)等，藥物靶標主要有CASP3(半胱天冬酶3)、Bax(凋亡調節劑Bax)、Bcl-2(凋亡調節劑Bcl-2)、mTOR(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR)、MAPK1(絲裂原激活的蛋白激酶1)、MAOB(單胺氧化酶B)、CDK5(細胞周期蛋白依賴性激酶-5)、GSK-3β(糖原合酶激酶3β)、INSR(胰島素受體)，這些藥物靶標主要涉及細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激反應、自噬、胰島素代謝等。

圖2 靶蛋白 PPI 網絡圖Fig.2 PPI network diagram of target protein

2.5 核心靶點分析結果

Cytoscape 3.7.1計算得到，PPI網絡平均度值為14.2，平均介數為3.6×10-2，平均緊密度為0.5，度值、介數和緊密度均超過平均值的靶蛋白共7個，依次為APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAOB、INSR，說明以上7個靶點在PPI網絡中處于鍵位置，很可能是四君子湯抗AD的關鍵靶點。

2.6 Metascape分析的KEGG和GO結果

通過GO數據庫分析，四君子湯有效成分靶標與AD疾病靶標基因功能有神經元凋亡過程、對β淀粉樣蛋白的反應、炎癥反應、氧化應激反應、老化、記憶、神經元凋亡過程的正調控、對氧化應激反應的調節、自噬、對胰島素的反應、細胞對胰島素刺激的反應、MAPK級聯反應、自噬的調控、神經系統發育等條目(見圖3)。說明四君子湯治療AD的機制可能與調控細胞凋亡、淀粉樣β蛋白聚集、炎癥反應、氧化應激反應、自噬、胰島素代謝等密切相關。

圖3 有效組分-基因靶點-分子功能的GO富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO enrichment of effective components-gene targets-molecular functions

通過KEGG數據庫富集四君子湯治療AD關鍵靶標所參與的通路主要涉及凋亡、阿爾茨海默病、MAPK信號通路、mTOR信號通路、NF-κB信號通路、Wnt信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、Notch信號通路、胰島素信號通路等(見圖4)，說明四君子湯可能主要通過調控細胞凋亡、炎癥反應、自噬、胰島素代謝等來防治AD。

圖4 前10個代表性的通路Fig.4 Top 10 representative pathways

2.7 四君子湯對 Aβ25-35誘導的 PC12細胞APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MAOB、mTOR、INSR mRNA的影響

Aβ25-35作用24 h，Bcl-2表達下調(P<0.01)，APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達上調(P<0.01)，表明 Aβ25-35可誘導活化各基因；四君子湯干預后，四君子湯中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達顯著升高(P<0.05，P<0.01)，APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見表3)。

表3 PC12細胞APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MAOB、mTOR、INSR mRNA表達比較Table 3 Comparison of APP,Caspase-3,Bax,Bcl-2,MAOB,mTOR,INSR mRNA expression in PC12 cells

3 討論

AD屬于中醫學“健忘”“癡呆”“呆證”等范疇，脾胃在AD發病中具有重要的作用。脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃能將化生的水谷精微運化至腦，以充養腦髓。Xia[13]認為脾胃運化功能旺盛，水谷精微化生有源，才能充血生精。脾胃虛弱，運化無力，則氣血津液化源不足，臟腑虧虛，后天之精來源匱乏，致腎精虛損，腦髓空虛，神機失用,發生癡呆。Zhang[14]指出脾胃虧虛，后天失養，一則腎精不足，不能充養腦髓；二則津液不足，無以內滲于骨空，而髓減腦消，發生癡呆。四君子湯始載于《太平惠民和劑局方》，為治脾胃氣虛的基本方。實驗研究表明，四君子湯水提液能提高Aβ25-35誘導的 HBMEC 損傷細胞的活性，調控GLUT1、LRP1、RAGE mRNA和LRP1蛋白、RAGE蛋白的表達，有助于Aβ跨血腦屏障轉運，減少Aβ在腦內的聚集[6]；四君子湯可能通過補脾作用，促進AD大鼠中樞能量生成，改善中樞的能量代謝紊亂，調節線粒體復合體活性及AMPK表達[7]。臨床研究發現[8]，四君子湯合黃連解毒湯治療阿爾茨海默病療效顯著。

本研究通過中醫藥整合藥理學研究平臺收集四君子湯中4味中藥有效成分和靶標，結果顯示：每味中藥可作用于多個靶標，多種中藥可同時作用于一個靶點，說明藥物間發揮作用有著密切的關系，各藥相須相使相輔相成。對基因功能和通路富集的分析顯示，四君子湯對 AD的干預作用主要涉及細胞凋亡、淀粉樣β蛋白聚集、炎癥反應、氧化應激反應、自噬、胰島素代謝等。通過構建四君子湯潛在藥物靶標與疾病靶標相互作用網絡，篩選出關鍵靶標7個，其中疾病靶標主要有PSEN1、PSEN2、APOE、APP等，藥物靶標主要有APP、CASP3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAPK1、MAOB、CDK5、GSK-3β、INSR。構建疾病靶標與有效成分的網絡，共有24種有效成分，四君子湯中與疾病靶標關系密切的有效成分主要為人參皂苷Rh2、人參二醇、茯苓多糖、異甘草素等。Cai[15]研究表明，人參皂苷Rh2能夠抑制Aβ25-35激活的BV-2細胞內前炎癥細胞因子表達，減輕炎癥反應，并進一步抑制氧化應激反應，從而減輕對神經元的損傷，在AD發病中具有保護作用。Liang等[16]研究發現，人參二醇可提高AD細胞模型的存活率，抑制乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，且能顯著抑制細胞凋亡，減輕內Ca2 +超載。Hou等[17]研究發現茯苓多糖能增強超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛的含量，均有利于生物體內自由基的清除，起到延緩衰老的作用。Li[18]研究發現異甘草素對Aβ25-35處理PC12細胞毒性及細胞凋亡有較好的保護作用。

采用四君子湯干預Aβ25-35誘導的PC12細胞模型驗證網絡藥理學研究結果，發現四君子湯可顯著上調Bcl-2表達，下調APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達。Aβ的異常沉淀是APP過度表達的后果[19]。Caspase-3是Caspases級聯反應中下行的最關鍵的凋亡執行蛋白酶，在各種程序啟動的細胞凋亡中起最后樞紐的作用[20]，是細胞凋亡的關鍵標志因子，有人稱之為“死亡蛋白酶”。研究表明，AD腦內神經元的丟失機制與細胞凋亡密切相關，海馬神經元凋亡是受各種基因調控的程序化死亡過程，其病理生理機制十分復雜，在凋亡發生機制中最關鍵的環節之一是Bc1-2和Bax對細胞凋亡的調控[21]。MAOB基因的異常表達或突變與AD的發生具有密切關系[22]。MAOB 活性下降有利于保持神經系統的正常功能，對機體的抗氧化及抗衰老有促進作用[23]。mTOR的活性是自噬體形成、成熟的關鍵[24]。Liu等[25]研究發現，在AD細胞模型中的INSR基因和蛋白水平均升高。四君子湯可上調Bcl-2表達，下調APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達，與預測其參與調控β淀粉樣蛋白聚集、細胞凋亡、氧化應激反應、自噬、胰島素代謝相吻合。故體外驗證實驗在一定程度上證實了網絡藥理學預測結果。

本研究基于網絡藥理學技術，采用整合藥理學平臺，建立了四君子湯成分-基因靶標的分子生物網絡、蛋白與蛋白相互作用網絡，從多個角度探索四君子湯治療AD的潛在分子機制。結果表明，四君子湯可通過調控β淀粉樣蛋白聚集、細胞凋亡、氧化應激反應、自噬、胰島素代謝等多靶點、多途徑發揮治療AD的作用，其具體機制及物質基礎還需通過更深入的實驗研究加以驗證。