基于網絡藥理學探討“黃芪-白術-熟地黃”組方防治腎病綜合征的作用機制

軒 晨，席雨蒙，張玉笛，陶春鶴，章藍月，曹文富,*

1重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科；2重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016

腎病綜合征是一類以大量蛋白尿，低蛋白血癥，水腫和高脂血癥為主要表現的臨床病理綜合征，是導致終末期腎衰竭的主要原因之一[1]。腎病綜合征發病機制復雜，尚不完全清楚。臨床以免疫調節，降低尿蛋白，改善腎功能和對癥治療為主，難以取得理想的治療效果。中藥具有多靶點多層次的優勢，在腎病綜合征的治療中具有良好的前景。

腎病綜合征屬于中醫“水腫”的范疇，與肺脾腎三臟功能異常有關[2]。HBS分別作用于肺(黃芪)、脾(白術)和腎(熟地黃)，是中醫治療腎病綜合征的常用藥物組合。研究表明，黃芪具有改善腎纖維化，保護腎功能的作用[3]；白術水煎劑可以有效減少腎病綜合征大鼠尿蛋白含量[4]；熟地黃可改善阿霉素腎病大鼠的腎功能，減輕腎纖維化[5]。本研究使用網絡藥理學的方法，從分子水平對HBS治療腎病綜合征的作用機制進行系統分析，為臨床應用和進一步研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 腎病綜合征基因收集和分析

在DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org)和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)中，以“Nephrotic syndrome”為關鍵詞查找腎病綜合征基因，根據相關性得分(Relevance score)對基因進行排序，將DisGeNET和GeneCards數據庫中相關性得分最大的100個基因整理匯總，以此構建腎病綜合征基因庫。然后將腎病綜合征基因輸入STRING(https://string-db.org)數據庫，選擇“Homo sapiens”作為目標物種，獲取基因相互關聯網絡。將該網絡導入Cytoscape3.6.0[6]軟件中，使用clusterMaker進行功能模塊分解，構建腎病綜合征基因模塊網絡。將每個模塊逐一輸入STRING數據庫進行Gene Ontology(GO)富集分析，提取相關生物學過程。

1.2 HBS化合物和靶點收集

在TCMSP數據庫(https://tcmspw.com)中輸入關鍵詞“黃芪”、“白術”和“熟地黃”，分別查找其所含化合物。根據口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18同時半衰期(HL)≥4作為標準對化合物進行篩選，滿足這些條件的化合物被定義為有效化合物[7]。此外，從PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)中查找黃芪、白術和熟地黃治療腎病綜合征的文獻，提取其中發揮治療作用的有效成分，作為有效化合物的補充。分別在TCMSP數據庫和SymMap數據庫(https://www.symmap.org)中查找各有效化合物所對應的基因靶點，構建藥物-化合物-靶點網絡。

1.3 篩選有效靶點

在Cytoscape3.6.0軟件中，以腎病綜合征基因相互關聯網絡為背景，篩選出HBS靶點和腎病綜合征基因的交集，作為HBS治療腎病綜合征的有效靶點。將有效靶點映射在腎病綜合征基因模塊網絡中，初步分析HBS治療腎病綜合征的作用機制。隨后，將有效靶點輸入STRING數據庫，選擇“Homo sapiens”作為物種背景，獲取有效靶點蛋白質相互作用網絡。

1.4 有效靶點富集分析

將有效靶點導入STRING數據庫中，分別進行GO和KEGG pathways富集分析，提取HBS治療腎病綜合征的主要生物學過程和信號通路，并以此構建靶點-生物學功能(TF)網絡和靶點-信號通路(TP)網絡，分析HBS治療腎病綜合征的可能生物學作用和信號通路。

1.5 構建HBS-腎病綜合征作用機制網絡

將藥物、化合物、有效靶點、生物學過程和信號通路信息進行綜合整理，導入Cytoscape3.6.0軟件中，構建HBS-腎病綜合征作用機制網絡。

1.6 分子對接

從RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org)中下載TGFβ1、PTGS2、IL1B、IL2、IL4、IL10、TNF和CD40LG的3D結構pdb格式文件，并通過PyMOL[8]軟件進行加氫、去水等處理。在ZINC數據庫(http://zinc.docking.org)中下載sitosterol、quercetin、formononetin、hederagenin、isorhamnetin、calycosin和kaempferol的mol2格式文件并使其能量最小化。在AutoDockTools[9]軟件中分別將蛋白和化合物轉換為pdbqt格式文件，最后運行分子對接。化合物與靶蛋白的結合能小于0說明結合性良好[10]。

2 結果

2.1 腎病綜合征基因

在DisGeNET數據庫和GeneCards數據庫中共篩選出166個腎病綜合征基因，通過分解得到6個功能模塊。對每個模塊逐一進行GO富集分析，富集結果表明，腎病綜合征基因參與的主要生物學過程包括細胞增殖和凋亡、腎臟發育、血脂調節、視覺感知、基因表達過程的調節以及線粒體基因的維持(見圖1)。

圖1 腎病綜合征基因功能模塊分解Fig.1 Module decomposition of nephrotic syndrome gene network

2.2 HBS化合物和靶點

通過文獻和數據庫共篩選出23個有效化合物(表1)。其中黃芪(HQ)17個，白術(BZ)4個，熟地黃(SDH)3個(Molecule 4在黃芪和白術中均含有)。有效化合物中，已被證實具有腎臟保護作用的包括astragalosideⅣ、atractylenolide I、acteoside和betaine。將這些有效化合物逐一輸入TCMSP數據庫和SymMap數據庫中，共得到221個不同的靶點。根據中藥、化合物和靶點的對應關系構建藥物-化合物-靶點網絡(見圖2)。

表1 HBS有效化合物表Table 1 Effective compounds of HBS

續表1(Continued Tab.1)

圖2 藥物-化合物-靶點網絡Fig.2 Drug-compound-target network

2.3 有效靶點

以腎病綜合征基因相互作用網絡為背景，共篩選出18個有效靶點。將有效靶點映射在腎病綜合征基因功能模塊中，映射結果顯示，有效靶點主要富集在調控細胞增殖和凋亡的基因模塊中(見圖3)。在STRING數據庫中構建有效靶點的蛋白質相互作用網絡(見圖4)。

圖3 有效靶點在腎病綜合征基因模塊網絡中的映射 Fig.3 Mapping of effective targets in gene clusters network of nephrotic syndrome.注：圖中紅色表示有效靶點。Note:Red color in the figure indicate the effective targets

圖4 有效靶點的蛋白質相互作用網絡Fig.4 PPI network of effective targets

2.4 TF網絡和TP網絡

對有效靶點進行GO富集分析(圖5A)，并根據富集結果構建TF網絡(見圖6)。GO富集結果表明除調控細胞增殖和凋亡外，有效靶點還參與了對炎癥反應和免疫反應過程的調節。此外，對有效靶點進行KEGG通路富集分析(見圖5B)，并構建TP網絡(見圖7)。KEGG富集結果顯示HBS靶點主要富集在PI3K/Akt、IL-17、FoxO、Jak/STAT、p53和NF-κB信號通路上。

圖5 GO富集分析(A)和KEGG通路富集分析(B)Fig.5 GO enrichment analysis (A) and KEGG pathways enrichment analysis (B)

圖6 HBS治療腎病綜合征的TF網絡Fig.6 TF network of HBS in the treatment of nephrotic syndrome

圖7 HBS治療腎病綜合征的TP網絡Fig.7 TP network of HBS in the treatment of nephrotic syndrome

2.5 HBS-腎病綜合征作用機制網絡

綜合整理藥物、化合物、有效靶點、生物學過程和信號通路信息，構建HBS-腎病綜合征作用機制網絡(見圖8)。網絡結構表明，HBS的16種化合物靶向18個有效靶點，這些靶點主要富集在6條信號通路上，通過調節細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應和免疫反應來發揮治療腎病綜合征的作用。

圖8 HBS-腎病綜合征作用機制網絡Fig.8 Mechanism network of HBS-Nephrotic syndrome

2.6 分子對接

使用分子對接技術將關鍵蛋白與HBS化合物進行對接驗證。有效靶點中有8個是介導免疫反應和炎癥反應的細胞因子，包括TGFβ1、PTGS2、IL1B、IL2、IL4、IL10、TNF和CD40LG[13]。這些炎性細胞因子參與了腎臟的慢性炎癥反應和病理損傷過程，是治療腎病綜合征的關鍵靶點。提取這些細胞因子和靶向他們的化合物進行分子對接驗證，對接結果見表2和圖9。結果表明HBS化合物與TGFβ1、PTGS2、IL1B、IL2、IL4、IL10、TNF和CD40LG等炎性細胞因子具有較好的結合活性。

圖9 分子對接模式圖Fig.9 Molecular docking pattern diagram

表2 分子對接表Table 2 Molecular docking table

3 討論

腎病綜合征發病因素復雜，包括免疫功能異常、炎癥反應、高血壓、糖代謝紊亂和病毒感染等。其中免疫功能異常和炎癥反應在原發性腎病綜合征的發生發展中起到重要作用[11]。腎病綜合征的病理機制尚不完全清楚，目前研究表明，由于長期慢性炎癥反應引起的腎小球足細胞過度凋亡、系膜細胞增生、細胞外基質堆積是導致包括蛋白尿、腎小球硬化和腎功能持續降低的關鍵因素[12]。本研究通過對腎病綜合征基因進行功能模塊分解和富集分析，證實了腎病綜合征病理進程與細胞增殖和凋亡過程的關聯。通過將HBS有效靶點映射在腎病綜合征基因模塊網絡中，發現有效靶點與調控細胞增殖和凋亡的基因模塊密切相關。此外，有效靶點的富集分析結果表明，除調控細胞增殖和凋亡外，有效靶點還參與了炎癥反應和免疫反應過程。由此，我們猜測HBS可能通過調節免疫反應和炎癥反應，改善系膜細胞和足細胞的增殖、凋亡水平，來發揮治療腎病綜合征的作用。

HBS通過16種化合物靶向18個有效靶點。其中TGFβ1、PTGS2、IL1B、IL2、IL4、IL10、TNF和CD40LG均為介導免疫反應和炎癥反應的關鍵細胞因子[13]，分子對接結果顯示，HBS化合物與這些炎性細胞因子具有較好的結合活性。此外，有效靶點中PTEN、Akt、TGF-β和TP53還與系膜細胞增殖、足細胞損傷和細胞外基質堆積過程有關[14,15]。有效靶點主要富集在IL-17、NF-κB、PI3K/Akt、FoxO、p53和Jak/STAT信號通路上。IL-17信號通路在急性和慢性炎癥中均發揮著重要作用，有效靶點中TNF、PTGS2、IL1B和IL4富集在IL-17信號通路上。研究表明在自身免疫性疾病中IL-17信號通路的激活與慢性炎癥反應的發生密切相關[16]，這表明對IL-17信號通路的調節可能是HBS改善免疫炎癥反應治療腎病綜合征的關鍵。NF-κB通路是炎癥反應的經典信號通路，TNF和IL1可以激活NF-κB信號通路，活化的NF-κB以p50/p65二聚體的形式進入細胞核并激活基因轉錄，進而誘導和推動炎癥反應進程[17]。PI3K/Akt信號通路可以被多種細胞因子激活，對細胞生長、增殖和凋亡等基本功能發揮調節作用[18]。包括INS和Akt在內的11個有效靶點富集在PI3K/Akt信號通路上，表明HBS可能通過調控PI3K/Akt信號通路，從而改善腎病綜合征狀態下腎臟細胞的異常增殖和凋亡。FoxO是PI3K/Akt信號通路的下游蛋白，FoxO信號通路被激活后，對細胞凋亡和葡萄糖代謝發揮調節作用[19]。在DNA損傷和氧化應激時p53信號通路被激活，激活后的p53信號通路可以引起包括細胞周期停滯、衰老和凋亡在內的一系列損傷過程[20]。這些信號通路在腎病綜合征的發生發展過程中均發揮著重要作用。表明HBS可能通過調節免疫反應和炎癥反應，改善改善系膜細胞和足細胞的增殖、凋亡水平，進而對腎病綜合征狀態下的蛋白尿和腎小球硬化發揮治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法對HBS治療腎病綜合征的作用機制進行系統分析。結果表明，HBS靶向IL-17、NF-κB、PI3K/Akt、FoxO、p53和Jak/STAT等信號通路上的關鍵靶點，可能通過調節免疫反應和炎癥反應，改善系膜細胞和足細胞的異常增殖和凋亡，進而減輕腎病綜合征狀態下的蛋白尿和腎小球硬化。然而本研究僅依托于數據庫信息，未考慮中藥劑量和煎服方法等問題。因此，所得結論需要通過實驗進一步驗證。