基于網絡藥理學-分子對接研究桑不同入藥部位防治糖尿病的作用機制

李德龍，何 韜，陳冰婷，伊麗則熱·艾拜杜拉，馬曉麗

新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011

桑科(Moraceae)桑屬植物桑(MorusalbaL.)，始載于《神農本草經》[1]，其葉子、果實、枝均可入藥，桑葉(Folium Mori，FoM)，性味苦甘寒，歸肺肝經，功效：疏風清熱，養肺明目，臨床上常應用于心腦血管病或脫發的治療[2]；桑椹(Fructus Mori，FrM)，性味甘寒，歸心腎經，補陰補血，生津潤腸[3]，被稱為“民間圣果”；桑枝(Ramulus Mori，RaM)，性味，苦平，歸肝，功效：祛風清熱通絡，常用于關節炎、風濕的治療[4]。從性味歸經來看，桑葉作用更加廣泛，現代醫學研究發現桑的不同入藥部位中雖然都含有黃酮、生物堿、多酚等功效組分，具有抗氧化、抗炎、降脂、降糖、抗癌、降壓等作用[5]，但各入藥部位的活性成分含量、藥理活性及臨床用途并不完全相同。如何客觀闡明桑各入藥部位活性成分群、預測生物學機制成為了推動桑資源基礎物質研究的關鍵問題。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種嚴重的代謝性疾病，對其有治療作用的中藥開發一直是當今的熱點與難點，而網絡藥理學是一種基于大數據分析的多元方法，能夠快速預測中藥的“成分-靶點-疾病”網絡，解釋中藥多成分起效的活性物質群，對評價中藥的藥用價值具有重要作用[6]。Liu等[7]采用網絡藥理學的方法發現甘草苷主要通過調控PI3K-AKT信號通路、癌癥信號通路、Ras信號通路發揮治療抑郁癥和糖尿病的作用。Ge等[8]通過網絡藥理學研究了桑葉粉末抗糖尿病的作用機制，鑒定并得到22種藥物成分，可調節TNF、PPARG、GSK3B、IRS1、IL-6等靶蛋白，它們與胰島素及炎癥信號通路、糖代謝等相關通路、慢性炎癥性疾病等有關。本課題組前期采用網絡藥理學方法預測了桑椹多成分協同防治防治糖尿病的作用機制[9]。

為進一步明確桑不同入藥部位的抗糖尿病作用，本文通過網絡藥理學策略，系統分析各入藥部位藥性差異及作用機制，對比、解釋桑不同部位防治糖尿病的關鍵藥效物質，結合生物信息注釋方法對藥性差異進行全新闡釋，為顯著提升桑的藥用資源開發領域，促進桑資源對復雜代謝性疾病防治提供全新的研究模式。

1 材料與方法

1.1 桑不同部位活性成分群及其潛在靶點的建立

通過TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM等中藥數據庫中藥名稱檢索及萬方、知網文獻檢索獲取桑葉、桑椹、桑枝的化合物成分信息及化合物對應的潛在靶標信息。參考TCMSP數據庫中口服生物利用度[10](oral bioavailability，OB≥30%)和類藥性(drug-like，DL≥0.18)等中藥體內ADME參數對化合物庫進行篩選，并將篩選后的活性成分對應的靶點名用Uniprot蛋白數據庫進行標準化處理，最終得到三個部位活性成分群及其潛在靶點。

1.2 桑不同部位活性成分-DM靶標網絡構建

在OMIM、TTD、GeneCards數據庫中以“type 2 diabetes”為檢索詞，整合得到II型糖尿病靶點信息，與成分靶點取交集，得到不同部位治療糖尿病的潛在靶點，利用Cytoscape 3.7.2軟件分別繪制桑不同部位活性成分-疾病靶點網絡圖。

1.3 篩選桑不同入藥部位的主要活性成分及其差異分析

通過不同入藥部位活性成分-疾病靶點的網絡篩選主要活性成分，將度值靠前的成分作為各入藥部位主要活性成分，并比較其共有成分與差異成分，判斷其藥性差異的物質基礎。

1.4 蛋白-蛋白互作網絡(PPI)構建

為了獲取與疾病有關的核心基因，我們分別將獲得的三個入藥部位的潛在作用靶點導入到STRING蛋白數據庫，限定物種為人，選取combined score>0.7的靶點作為核心靶點，將結果數據導入到Cytoscape 3.7.2軟件中構建PPI網絡。

1.5 GO分類富集分析與通路分析

將獲得的核心靶點導入到WebGestalt(www.webgestalt.org/#)基因富集分析在線工具中進行多組間GO注釋分析與KEGG通路富集分析(FDR<0.05)，比較并分析三個組織部位對2型糖尿病的作用機制。

1.6 分子對接

應用AutoDock vina 軟件將三個部位PPI 網絡中度值排名前3的5個靶點分別與3個共有成分、8個度值靠前的差異化合物進行分子對接驗證，并用臨床常用藥物二甲雙胍(metformin)作為對照。分別從PDB蛋白質結構數據庫和ZINC數據庫中下載受體的晶體結構和配體的化學結構，MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG對應的PDB ID分別為3PZE、6S9W、4KZN、1ALU、6MS7，采用AutoDock Tools工具對上述蛋白受體和配體進行常規處理，再用其Autogrid模塊得到對接活性位點，運行程序進行分子對接，得到結合能 (affinity)。本研究以結合能< -5.0 kcal/mol為分子與靶點結合性較好的條件。

2 結果

2.1 活性成分的篩選及疾病靶點的獲取

通過檢索數據庫和相關文獻并剔除掉沒有明顯藥效的化合物后得到FoM中194個化合物，FrM中72個化合物，RaM中30個化合物，主要分為黃酮類、多糖類、揮發油、生物堿以及氨基酸類等，對三者作韋恩圖比較(圖1A)，只有5種共有化合物桑黃酮(kuwanon c)、1-脫氧野尻霉素(DNJ)、桑色素(morin)、東莨菪內酯(scopoletin)、肌肉肌醇(myo-inositol)，三個入藥部位化合物種類差異明顯。根據OB及DL參數篩選并刪除一些一物多名的化合物與重復重現的靶標以及一些沒有明確對應靶標的化合物后，FoM有45個活性化合物和232個化合物所對應的靶點，FrM中有29個活性化合物和350個化合物所對應的靶點，RaM中有16個活性化合物和153個化合物所對應的靶點，這表明化合物與靶點的差異可能是桑不同入藥部位作用差異的原因。在OMIM、TTD、GeneCards數據庫中篩選得到II型糖尿病靶點284個，與不同入藥部位活性成分作用靶點取交集(圖1B)，得到FoM治療靶點24個(PTGS2、PTGS1、PPARG、F2、DPP4等)，FrM治療靶點31個(PPARG、PTGS2、PTGS1、NFKB1、TP53等)，RaM治療靶點22個(PTGS2、PTGS1、MGAM、DPP4、F2等)，三者共有的治療靶點13個(MGAM、PIK3CG、DPP4、PPARG、TP53等)。

圖1 三個入藥部位整體化合物Venn圖(A)與ADME篩選后化合物靶點與疾病靶點Venn圖(B)Fig.1 Venn’s diagram of all compounds (A) and compound target-disease target after ADME screening (B) in three parts of M.alba

2.2 桑不同部位活性成分-DM靶標進行網絡構建

將三個入藥部位的活性化合物靶標與疾病靶標映射后作活性成分-疾病靶點網絡圖(圖2～4)，FoM生成62個節點，136條邊；FrM生成46個節點，57條邊；RaM生成37個節點，65條邊，節點大小和顏色表示該節點自由度值的大小，節點越大，由綠色變紅色對應的度值越大。其中FoM中度值較大的成分及度值為槲皮素(quercetin，16)、山奈酚(kaempferol，15)、甲基丁香酚(mthyleugenol，5)、丁香酚(eugenol，5)等，度值較大的靶點及度值為環氧合酶2(PTGS2，31)、環氧合酶1(PTGS1，24)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，15)、凝血酶原(F2，13)等；FrM中度值較大的成分及度值為槲皮素(quercetin，14)、反式白藜蘆醇(trans resveratrol，9)、甲酸(FMT，6)、楊梅素(myricetin，5)等，度值較大的靶點及度值為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，6)、環氧合酶2(PTGS2，5)、環氧合酶1(PTGS1，4)、DNA結合因子KBF1(NFKB1，3)等；RaM中度值較大的成分及度值為有山奈酚(kaempferol，15)、苦來西堿(cularicine，9)、桑色素(morin，6)、二氫山奈酚(dihydokaempferol，6)等，度值較大的靶點及度值為環氧合酶2(PTGS2，10)、環氧合酶1(PTGS1，9)、麥芽糖淀粉酶(MGAM，8)、二肽酰肽酶IV(DPP4，8)等，這些化合物和靶點可能是桑源藥材干預糖尿病的主要化合物與靶點。三者13種共有靶點中PTGS1、PTGS2、PPARG、F2、DPP4均度值靠前，但是PIK3CG只在FoM中度值靠前，TP53只在FrM中度值靠前，MGAM只在RaM中度值靠前；另外，FoM中沒有獨有靶點，FrM中13種獨有靶點中NFKB1度值靠前，RaM中3種獨有靶點中沒有度值靠前的靶點。這些主要化合物與靶點的差異也進一步提示不同入藥部位防治糖尿病作用機制的不同。

圖2 FoM化合物-DM疾病靶點網絡圖Fig.2 Network of FoM ingredients-disease target

2.3 篩選桑不同入藥部位的主要活性成分及其差異分析

將各部位成分-疾病靶點網絡圖中的化合物進行整理，得到FoM中有38個成分，FrM中有15個成分；RaM中有15個成分，將三部位成分進行韋恩分析，見表1，并結合各部位成分-疾病靶點網絡圖分析其度值，發現三部位中共有的主要成分有3個：桑色素、東莨菪內酯、1-脫氧野尻霉素。桑色素是RaM中度值較高的成分；FoM中的特有成分有26個，其中丁香酚和甲基丁香酚是其度值較高的成分；FrM中的特有成分有6個，其中反式白藜蘆醇與楊梅素是其度值較大的成分；RaM中的特有成分有9個，其中苦來西堿與二氫山奈酚是其度值較大的成分。兩兩比較中，FoM與FrM共有成分為9個，槲皮素為兩者中高度值的成分，FoM與RaM共有成分為6個，其中山奈酚為兩者中高度值的成分。有趣的是FrM與RaM都有15個主要成分，但共有成分僅有3個常見成分，從三部位個差異成分的個數比較得出，FoM分別與FrM和RaM在防治糖尿病方面可能具有相似的作用，FrM與RaM在防治糖尿病方面可能作用的途徑差異較大。

圖3 FrM化合物-DM疾病靶點網絡圖Fig.3 Network of FrM ingredients-disease target

圖4 RaM化合物-DM疾病靶點網絡圖Fig.4 Network of RaM ingredients-disease target

表1 三個入藥部位活性成分差異Table 1 Different active components of three parts used in medicine

2.4 蛋白-蛋白互作網絡(PPI)構建

將STRING數據庫中按照結合分數(combined score)> 0.7篩選后的核心靶點相互作用關系導入到Cytoscape 3.7.2軟件中分別構建三個部位PPI核心網絡(圖5)，邊越粗結合分數越大，節點越大表明度值越大，FoM中共有22個節點，74條邊，其中胰島素(INS，14)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8，12)、α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，12)靶點度值排名靠前；FrM中共有26個節點，80條邊，其中

圖5 三部位PPI網絡圖Fig.5 PPI network of three parts注：A：FoM；B：FrM；C：RaM。

胰島素(INS，14)、α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，14)、血管內皮生長因子A(VEGFA，13)靶點度值排名靠前；RaM中共有16個節點，40條邊，其中度值排名靠前的靶點有白細胞介素-6(IL6，9)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，8)、α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，8)。三個入藥部位共涉及32個核心靶點，這些度值排名靠前的靶點可能是與糖尿病有關的關鍵靶點。

圖6 三個入藥部位GO富集分析柱狀圖Fig.6 Column diagram of go enrichment analysis in three parts注：A：FoM；B：FrM；C：RaM。

2.5 GO分類富集分析與通路分析

2.5.1 GO富集分析

將獲得的三個部位的核心靶點導入WebGestalt在線工具中進行GO分析(FDR<0.05)：生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)。發現FoM中與BP相關的條目有細胞對含氧化合物的反應、急性炎癥反應調節、細胞對有機氮化合物的反應、細胞增殖調控、細胞凋亡調節、代謝過程調節、細胞對胰島素刺激的反應等993條；CC相關條目有膜筏、內質網、細胞表面等13條；MF相關條目有信號受體結合、蛋白磷酸酶2A結合、相同蛋白結合、胰島素樣生長因子受體結合等33條。FrM中與BP相關條目有細胞增殖調控、細胞對含氧化合物的反應、凋亡過程調控、轉運調控、急性炎癥反應調節、脂質代謝過程的調控、氧化應激反應等983條；CC相關條目有內質網腔、分泌顆粒、分泌囊泡等8條；MF相關條目有相同蛋白結合、信號受體結合、蛋白質二聚活性、脂肪酸結合、胰島素樣生長因子受體結合等66條。RaM中與BP相關條目有活性氧代謝過程的正調節、急性炎癥反應的調節、細胞對含氧化合物反應、細胞凋亡調節、對有機氮化合物反應、細胞增殖等886條；CC相關條目有膜微域、內質網、轉移含磷基團的轉移酶復合物等12條；MF相關條目有信號受體結合、蛋白質磷酸酶結合、受體配體活性、抗氧化活性等36條。將本體條目按注釋到的基因數目進行功能分類做柱狀圖(圖7A～C)，可以看到涉及多個生物過程，其中所有靶點都與代謝過程有關，而糖尿病又是代謝紊亂的疾病，桑的三個入藥部位有可能主要干預代謝過程發揮治療糖尿病的作用，對三者BP進行比較分析發現其都涉及細胞對含氧化合物的反應、急性炎癥反應調節、細胞對有機氮化合物的反應、細胞增殖調控、細胞凋亡調節等生物過程，三者中尤以桑葉靶點功能最多(993條)，桑椹其次(983條)，桑枝最少(886條)，此結果可能表明調節代謝過程能力：桑葉>桑椹>桑枝。

圖7 分子對接的3D和2D模式圖Fig.1 3D and 2D pattern diagrams of molecular docking注：A：苦來西堿-MAPK8；B：苦來西堿-AKT1；C：二氫山奈酚-VEGFA；D：苦來西堿-IL6；E：槲皮素-PPARG。Note:A:Cularicine-MAPK8;B:Cularicine-AKT1;C:Dihydrokaempferol-VEGFA;D:Cularicine-IL6;E:quercetin-PPARG.

2.5.2 通路分析

利用WebGestalt在線工具對三個入藥部位治療DM的核心靶點進行KEGG通路富集分析(FDR<0.05)，FoM靶點有83條通路，FrM有80條，RaM有93條。分別選取FDR值排名前20的通路，見表2～4，通路富集分析結果表明三個入藥部位的作用通路主要涉及疾病通路、炎癥與免疫相關通路等。FoM中與疾病有關的通路有胰島素抵抗、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、II型糖尿病、胰島素信號通路癌癥等；炎癥與免疫相關通路主要有脂肪細胞脂肪分解的調節、C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等。FrM中與疾病有關的通路有流體剪應力與動脈粥樣硬化、前列腺癌、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥、胰島素抵抗；免疫與炎癥相關通路有脂肪細胞脂肪分解的調節、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、AMPK信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、血管內皮生長因子信號通路等。RaM中與疾病有關的通路有胰島素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、II型糖尿病、胰島素信號通路、乙肝等；免疫與炎癥相關通路有C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、AMPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。三個入藥部位通路富集分析都有糖尿病及其并發癥通路與大量的炎癥通路，可以看出糖尿病與炎癥具有密不可分的關系[11]。

表2 FoM治療靶點KEGG通路富集分析Table 2 Enrichment analysis of KEGG pathway in FoM therapy target

續表2(Continued Tab.2)

表3 FrM治療靶點KEGG通路富集分析Table 3 Enrichment analysis of KEGG pathway in FrM therapy target

表4 RaM治療靶點KEGG通路富集分析Table 4 Enrichment analysis of KEGG pathway in RaM therapy target

續表4(Continued Tab.4)

2.6 分子對接

將三個部位PPI 網絡中度值排名前3的5個靶點蛋白MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG分別與metformin、3個共有成分(A)和度值靠前的8個差異化合物(B)進行分子對接驗證，結果見表5。若結合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白能自發地結合，結合能<-5.0 kcal/mol，表明其結合良好，結合能越小結合性越好。表中70%成分能與靶點蛋白較好地結合，且90%的成分結合性均好于對照藥。與5個靶點最佳的分子對接如圖8，其中苦來西堿與AKT1結合最好為-10.9 kcal/mol，苦來西堿(cularicine)與AKT1活性位點氨基酸殘基ASP292是形成π-陰離子相互作用、與 TRP80形成π-π堆積作用等非鍵相互作用。結果表明，這12 種成分與靶點蛋白結合性能較好。

表5 三部位差異化合物與核心靶點分子對接結果Table 5 Results of molecular docking between differentially active compounds and target proteins

3 討論

糖尿病是一種發病率高，危害性大的代謝性疾病，有研究表明[11]糖尿病的發生發展與炎癥具有密切的關系，本研究也發現桑治療糖尿病的潛在靶點VEGFA、IL6、MAPK8、TNF、TP53等與炎癥通路有關。

桑葉，性味苦甘寒，歸肺肝經[2]；桑椹，性味甘寒，歸心腎經[3]；桑枝，性味，苦平，歸肝[4]。從桑各部位性味歸經來看，桑葉作用更加廣泛，桑椹與與桑枝作用差異較大。通過化合物-疾病靶點網絡表明桑的不同入藥部位防治糖尿病的化合物種類及其作用靶點具有明顯差異，從三部位差異化合物的個數比較得出，FoM分別與FrM和RaM在防治糖尿病方面可能具有相似的作用，FrM與RaM在防治糖尿病方面可能作用的途徑差異較大，這與各部位性味歸經相符。三個入藥部位中桑色素、東莨菪內酯、1-脫氧野尻霉素3種為共有化合物，丁香酚、甲基丁香酚、反式白藜蘆醇、楊梅素、苦來西堿、二氫山奈酚、槲皮素、山奈酚8種為度值靠前的差異化合物。有研究表明[12]桑色素是一種PTP1B的非競爭性抑制劑，能起到胰島素增敏的作用，還能通過抗氧化與抗炎作用對胰島細胞起保護作用[13]；東莨菪內酯是一種天然植物抗毒素，Jang等[14]發現東莨菪內酯通過激活3T3-L1脂肪細胞的PI3K和AMPK途徑，促進GLUT4易位到PM，從而促進葡萄糖攝取，具有抗糖尿病作用。1-脫氧野尻霉素是從桑中發現的一種重要生物堿，對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并可以促進糖酵解，抑制糖的異生，降低膽固醇合成，還能抑制胰島素的分泌，改善胰島素抵抗的作用[15]。甲基丁香酚是一種是丁香酚的衍生物，具有鎮痛抗炎與抗氧化應激的作用[16]。反式白藜蘆醇能通過激活細胞內的SIRT1和AMPK通路緩解胰島素抵抗，保護胰島B細胞功能[17]。楊梅素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌和鎮痛等藥理活性，它還具有抗糖尿病的作用，對人胰島淀粉樣多肽(HIAPP)誘導的胰腺β-細胞的細胞毒性和胰島功能的恢復有保護作用[18]。苦來西堿是RaM中特有成分，并且與AKT1、MAPK8、IL6分子對接得分較高，目前還未見報道其藥理作用，其對AKT1的高結合性有待進一步的實驗驗證。山奈酚通過抑制肝臟糖異生和提高肝臟胰島素敏感性來改善肥胖小鼠的高血糖[19]。桑的各部位的主要活性成分在改善糖尿病方面具有多種功效、為桑的不同部位防治糖尿病的活性成分群及其作用機制的研究奠定了理論基礎。

PPI網絡中桑的三個部位按度值排名靠前的靶點有MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG。在分子對接中12種成分都能與這些靶點較好結合。VEGF是一種與肝素結合的同型二聚體蛋白，在生理和病理條件下調節血管生成和血管通透性，有研究表明[20]VEGFA的表達與糖尿病具有相關性。MAPK8是MAP激酶家族的成員。MAP激酶是多種生化信號的整合點參與，細胞的增殖、分化、轉錄調控和發育等多種過程。這種激酶被各種細胞刺激物激活，并針對特定的轉錄因子，從而介導細胞刺激后的早期基因表達。Guo等[21]采用Gene-ChipTM miRNA 4.0 Array篩選糖尿病人外周血血清發現MAPK8等7個基因可能與2型糖尿病胰島素抵抗有關。AKT1調控著許多過程，包括新陳代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成，并且AKT1基因多態性與代謝綜合征風險相關[22]。IL6是一種重要的炎癥因子，參與多種免疫反應，其在糖尿病病人中有顯著升高[23]。PPARG控制著脂肪酸的過氧化物酶體β氧化途徑，是脂肪細胞分化和葡萄糖穩態的關鍵調節因子，其表達量與2型糖尿病的風險有關[24]。這些結果與分子對接結果表明MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG這5個靶點可能是桑源藥材治療糖尿病的關鍵靶點。

從KEGG富集結果分析可知，桑的三種入藥部位主要從炎癥與免疫相關信號通路發揮治療糖尿病的作用，包括白介素-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-AKT信號通路和MAPK信號通路等。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)通過介導生長因子信號在生物體生長、葡萄糖穩態、脂質代謝等方面起著重要作用，是胰島素信號轉導的主要途徑，是調控血糖的主要信號通路，PI3K/Akt信號通路異常是糖尿病發生的重要原因[25]。IL-17是一種促炎性細胞因子。在糖尿病的發展中，p38MAPK與腎組織損傷密切相關。一方面，高血糖、血流動力學異常、氧化應激以及前炎癥因子等多種因素可以在上游誘導p38MAPK信號通路激活， 另一方面，活化的p38MAPK信號通路可以通過誘導下游炎癥細胞活化，促進炎癥介質表達，干預細胞因子產生等途徑而導致腎組織炎癥性損傷[26]。研究結果表明，顯著富集的信號通路中也存在著部分調控其他疾病的通路，例如前列腺癌信號通路、非酒精性脂肪肝信號通路、動脈粥樣硬化信號通路等。表明機體代謝是相互關聯的，藥桑可以通過作用于全身其他系統發揮間接治療糖尿病的作用。

總之，本研究首次應用網絡藥理學思路與方法揭示了桑的不同入藥部位防治糖尿病的成分群及其作用機制，為研究同源異效的中藥資源提供了新的思路，為合理利用桑資源提供了理論參考。