2-羥基-3-甲基蒽醌抑制結直腸癌的作用及機制研究

譚佳妮，劉文豪，沈衛星，孫東東*，程海波*

1南京中醫藥大學轉化醫學研究中心 國家中醫藥管理局名醫驗方評價與轉化重點實驗室 江蘇省抗腫瘤驗方與產業化工程實驗室；2江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，南京 210023

結直腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，在我國其發病率呈明顯上升趨勢，死亡率居第2位[1,2]。結直腸癌早期病發隱匿，大部分確診時已處于中晚期。手術化療為目前結直腸癌的主要治療手段，但術后2年內復發率高達50%，此外嚴重的副作用使患者生活質量明顯下降[3]。越來越多的研究發現中醫藥具有抑制結直腸癌復發轉移、減輕放化療毒副作用的優勢，已成為結直腸癌治療的重要手段之一。白花蛇舌草具有清熱解毒、利尿消腫的功能，藥理學研究表明其具有明顯的抗腫瘤活性，臨床上多與其他藥物配伍用于抗腫瘤治療，效果顯著且毒副作用小[4,5]。蒽醌類化合物在白花蛇舌草中含量較高，屬于其特征性成分。2-羥基-3-甲基蒽醌(HMA)是白花蛇舌草中具有抗腫瘤效應的蒽醌類化合物之一，具有抑制白血病、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞增殖的作用[6-8]，但其對結直腸癌的影響及作用機制尚未見報道。本研究以人結直腸癌細胞為研究對象，觀察了HMA對結直腸癌細胞增殖活性的影響，并對其作用機制進行了探討。

1 材料與儀器

1.1 試驗藥物

2-羥基-3-甲基蒽醌購自上海源葉生物科技有限公司(批號：B50429)化合物溶于DMSO中，配制成母液，置于-40 °C低溫儲存。

1.2 試劑與儀器

RPMI-1640高糖培養基、胰蛋白酶溶液、青霉素-鏈霉素溶液(上海源培生物技術有限公司，批號:F40411，K40410，E40401)；胎牛血清(Capricorn scientific公司，批號：1705124)；MTT、DMSO(Sigma公司，批號：SP1080、SHBH2446V)；細胞裂解液(Bio-sharp公司，批號：6503595)；Hoechst33342-PI染色液、GSH和GSSG檢測試劑盒(碧云天，貨號：S0053、C1028)；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司，批號：556547)；Bax、Bcl-2、PARP-1、Cleaved PARP、Keap-1、Nrf-2、HO-1、GAPDH及Lamin B1抗體(CST公司，貨號：5023、51071、9532、6987、8047、12721、86806、5174、13435)：Pall超純水系統(美國Pall公司)；CPA225D萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；FC型酶標儀、HERAcell150i型二氧化碳培箱(美國Thermo公司)；ECLIPSETi-5型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BD FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；Tanon-5500型化學發光凝膠成像儀器(中國天能科技有限公司)：Power PacTMBasic型電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

人結直腸癌HT-116細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。細胞置于37 °C，5% CO2培養箱內。使用含10%FBS及100 U/mL青鏈霉素的PRMI-1640高糖完全培養基。取對數生長期的細胞用于實驗，細胞融合度約90%時用胰蛋白酶消化傳代或種板。

2.2 細胞增殖活性檢測

取對數生長期結直腸癌細胞，調整細胞密度104個/ mL加入96孔板中，100 μL/孔，置于5%CO2孵箱中，24 h棄掉培養上清后分別加入25、50、100 μM的HMA，平行設6個復孔，繼續培養24、48、72 h。干預結束后每孔加入10 μL CCK-8繼續培養4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度A值，根據A值計算各濃度HMA對細胞增殖的抑制作用。實驗重復3次。

2.3 細胞凋亡檢測

取對數生長期結直腸癌細胞，調整細胞密度106個/ mL加入6孔板中，1 mL/孔，置于37 ℃ 5% CO2孵箱中過夜。次日，棄掉培養上清后加入各濃度HMA，設3個復孔，繼續培養24 h。給藥結束后，棄去培養上清，PBS清洗，1 mL空白培養基中，加入Hoechst染液，終濃度為5 μg/mL，37 ℃避光孵育10 min。繼續加入PI染液，終濃度為5 μg/mL，37 ℃避光孵育10 min。染色結束后，直接在熒光顯微鏡下觀察，Heochst-33342用氪激光激發的紫外光，激發波長為352 nm，發射波長為400～500 nm，產生藍色熒光；PI用氬離子激光激發熒光，激發波長為488 nm，發射波波長大于630 nm，產生紅色熒光。

2.4 細胞內ROS檢測

六孔板中，HMA作用于HCT-116細胞24 h后，用PBS洗滌，加入終濃度為10 μM的DCFH-DA中，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。熒光顯微鏡下觀察細胞內ROS含量變化情況。實驗重復3次。

2.5 細胞內GSH含量檢測

用HMA處理HCT-116細胞24 h后，用PBS洗滌細胞一次，按GSH和GSSG試劑盒說明(碧云天)對樣本進行處理：除去蛋白后，利用液氮和37 ℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融。冰浴放置5分鐘。于4 ℃，10 000 rpm離心10 min。取上清用于總谷胱甘肽的測定。實驗重復3次。

2.6 Western blot檢測細胞蛋白變化

對數生長期結直腸癌細胞，貼壁后培養至細胞溶合80%～90%時，分別加入HMA孵育48 h后，收集空白組細胞及處理后的細胞，RIPA裂解液(碧云天)裂解細胞提取蛋白。用BCA法定量蛋白，調整蛋白濃度統一后，95 ℃金屬浴中變性10 min。10%～12%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。濕轉法轉膜將蛋白轉至PVDF膜上后應用10%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜。次日，PBST洗膜3次后，室溫孵育二抗1 h，應用增強型化學發光試劑(ECL)發光試劑盒進行顯色，Gel Analysis軟件進行條帶分析。實驗重復3次。

2.7 氧化還原水平改變，對細胞凋亡影響的驗證

為進一步驗證細胞內氧化還原平衡狀態破壞誘導了結直腸癌細胞的凋亡，我們對HCT-116細胞預先用1 mM NAC處理1 h后，再加入50 μM HMA共孵育24 h后對細胞凋亡的影響。實驗重復3次，并對結果進行分析。

2.8 統計學分析

圖1 HMA(2-羥基-3-甲基蒽醌)結構式Fig.1 The chemical structure of HMA

3 結果

3.1 HMA對結直腸癌細胞增殖的影響

檢測HMA對肝癌細胞株HCT-116細胞生長的抑制作用結果如圖2所示，隨著HMA濃度的增加，其對HCT-116細胞生長的抑制作用增強。HMA作用HCT-116細胞24、48和72 h后，細胞的生長明顯受到抑制，且抑制作用隨作用時間的延長而增強，呈時間相關性。在作用細胞24、48和72 h時，其IC50分別為85.27±7.931、52.38±7.719、47.29±5.675 μM。考慮到作用效果更明顯，在后續實驗中我們將HMA給藥時間定為48 h，給藥劑量設為25、50、100 μM。

圖2 HMA對HCT-116細胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory rate of HMA on human 注：與對應時間點空白對照組比較，*P<0.05，** P<0.01，***P<0.001.Note:Compared with control,*P<0.05,** P<0.01,***P<0.001.

3.2 HMA對細胞形態及凋亡的影響

熒光染料Hoechst 33342可以少許的進入正常細胞膜的，使其染上低藍色，而凋亡細胞中的Hoechst 33342染料比進入正常細胞的多，藍色熒光增強。同時，活細胞對PI染料拒染，壞死的細胞可以被PI染料著色(紅色)。根據以上這些特性，用Hoechst 33342染料結合PI染料對細胞進行雙染色，可以通過熒光顯微鏡將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。染色結果如圖3所示，正常細胞形態呈多邊形、淡藍色；而低中劑量HMA給藥組的細胞，由于細胞核內Hoechst濃集而呈亮藍色，或核呈碎片狀。100 μM HMA給24 h后，細胞會被PI著色呈紅色。

圖3 HMA對HCT-116細胞凋亡的影響(20×)Fig.2 The effect of HMA on apoptosis in HCT-116 cells

3.3 HMA對細胞內ROS含量的影響

采用DCFH-DA熒光探針，通過檢測DCF的熒光強度檢測HMA給藥后細胞內的ROS水平變化，檢測結果如圖4所示：隨著HMA給藥濃度的增加，HCT-116細胞中DCF的綠色熒光逐漸增強。提示，化合物HMA會顯著升高細胞內的ROS水平，破壞了細胞內的氧化還原平衡。

圖4 HMA對HCT-116細胞內ROS含量的影響(20×)Fig.4 The effect of HMA on the level of ROS in HCT-116 cells

3.4 HMA對GSH的影響

GSH是細胞內的主要抗氧化劑之一，它可以直接清除ROS，或者可以做為谷胱甘肽過氧化物酶以及脂質過氧化物酶的主要輔助因子間接的清除細胞內的活性氧。實驗檢測了HMA給藥后，HCT-116細胞內GSH含量的變化情況，結果如圖5所示：正常組細胞內的GSH含量為75.56±5.91 μmol/g prot；給予化合物HMA(25、50和100 μM)48 h后細胞內GSH含量顯著下降，變為59.81±4.79、34.51±2.98、10.79±1.29 μmol/g prot。

圖5 HMA對HCT-116細胞內GSH含量的影響 Fig.5 The effect of HMA on intracellular GSH content in HCT-116 cells n =3) 注：與空白對照組比較，*P<0.05，** P<0.01，***P<0.001，下同。Note:Compared with corresponding control,*P<0.05,** P<0.01,***P<0.001,the same below.

3.5 HMA對細胞凋亡相關蛋白及通路的影響

利用Western blot方法檢測HMA對凋亡蛋白Bax,Bcl-2表達以及PARP-1蛋白活化水平的影響。結果如圖6所示，與對照組相比，HMA可引起Bax蛋白表達上調，而Bcl-2蛋白表達下調，Bax/Bcl-2比值升高。同時，隨HMA給藥濃度的增加，Cleaved PARP蛋白活化水平也逐漸升高，提示HMA對凋亡蛋白具有明顯的誘導作用。

圖6 HMA對HCT-116細胞凋亡蛋白表達的影響Fig.6 The effect of HMA on the expression of apoptosis-related proteins in HCT-116 cells

3.6 對Keap-1/Nrf-2/HO-1信號通路蛋白的影響

HMA對Nrf-2 /ARE信號通路影響如圖7所示，HCT-116細胞經HMA處理后細胞內Keap-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1)、Nrf-2和HO-1的表達明顯下降，蛋白的表達量且與HMA濃度呈負相關。此外，隨著HMA濃度升高，HCT-116細胞胞核中Nrf-2蛋白表達明顯下降，細胞質中Nrf-2蛋白表達明顯上升，并且與濃度有關。圖8顯示HMA可顯著抑制Nrf-2從細胞質中遷移至細胞核，進而抑制 Nrf-2入核與下游的多效應靶基因 ARE結合，使轉錄產物包括HO-1等多種抗氧化酶的表達降低。綜合以上，HMA誘導人結直腸癌HCT-116細胞凋亡的機制與Nrf-2的核移位及Keap-1/Nrf2/HO-1信號通路有關。

圖7 HMA對HCT-116細胞內Keap-1/Nrf-2/HO-1信號通路轉導的影響Fig.7 The effect of HMA on the expression of Keap-1/Nrf-2/HO-1 signal pathway in HCT-116 n =3)

圖8 HMA對HCT-116細胞Nrf-2核移位的影響Fig.8 The effect of HMA on the expression of Nrf-2 in HCT-116 n =3)

3.7 氧化還原水平改變，對細胞凋亡影響的驗證

為探討HMA誘導HCT-116細胞凋亡是否與其促氧化作用有關，HCT-116細胞預先加入1 mM NAC 1 h后與50 μΜ HMA共同作用24 h，再采用FITC-Annexin V/PI雙染對細胞凋亡率進行檢測，結果如圖9所示，NAC可顯著抑制HCT-116細胞凋亡，細胞凋亡率由51.32%±3.45%(對照組)變為23.6%±3.91% (50 μΜ HMA+1 mM NAC)。

圖9 NAC對HMA誘導細胞凋亡的逆轉Fig.9 The reversal effect of NAC on apoptosis induced by n =3)

4 討論

細胞內氧化還原的平衡狀態是細胞存活的關鍵。當細胞內ROS產生過量或抗氧化系統受抑制時，會出現氧化還原失衡，進而誘導細胞發生氧化應激。細胞內氧化應激水平過高時則會進一步誘導細胞發生壞死或凋亡[9,10]。在本項研究中，我們首先檢測了化合物HMA作用HCT-116細胞48 h后細胞內ROS/GSH含量的變化及給藥后細胞增殖情況。發現，在給予HMA后，結直腸癌細胞內的ROS水平升高、GSH水平顯著下降。為驗證HMA引起的細胞內ROS累積與其誘導細胞凋亡的關系，我們用還原劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理細胞后，再給予化合物HMA觀察細胞的凋亡率。結果顯示，NAC可降低HMA誘導的細胞凋亡。因此，HMA誘導HCT-116細胞凋亡與細胞內ROS聚集，GSH含量下降，細胞內氧化還原水平失衡有關。

Keap1和Nrf-2共同組成的Keap1/Nrf-2信號通路，具有維持氧化和抗氧化的平衡以及抑制細胞凋亡等多種生物學效應[11,12]。正常細胞內的Nrf-2受到胞質中抑制劑Keap1的嚴格調控。當細胞受到氧化應激刺激時，Keap1發生構像改變，激活Nrf2從泛素結合部位脫落并進入細胞核，并可與下游的ARE(anti oxidantre-sponseelement)結合發生反應，介導一系列抗氧化應激酶如 MnSOD、HO-1的產生，提高機體抗氧化能力[13,14]。本實驗發現，HCT-116結直腸癌細胞經HMA處理后細胞內Keap-1、Nrf-2和HO-1的表達下降。此外，隨著HMA濃度升高，結直腸癌細胞胞核中Nrf-2 蛋白表達明顯下降而細胞質中Nrf-2 蛋白表達明顯上升。綜上，HMA作用機制如圖10所示：HMA通過Keap-1/Nrf-2/HO-1通路破壞了細胞內的氧化還原平衡，進而引起細胞發生凋亡。

圖10 HMA作用機制簡圖Fig.10 The anti-proliferative mechanism of HMA

白花蛇舌草做為清熱解毒藥物，可通過誘導腫瘤細胞凋亡、調控細胞能量代謝、增強機體免疫功能等發揮抗腫瘤作用[15,16]。蒽醌做為其有效成分之一，具有抑制多種腫瘤細胞增殖的作用[7]，但其作用機制尚未完全闡明。本研究表明，HMA通過調控Nrf-2/ARE抗氧化信號通路，誘導細胞內ROS聚集及GSH的降解，破壞了細胞內的氧化還原平衡，誘導細胞發生凋亡。本研究探索了HMA誘導結直腸癌細胞凋亡的作用及可能的分子機制，以期為白花蛇舌草及其活性化合物的臨床應用提供可靠的理論基礎和實驗依據。