山楝枝葉中兩個新的倍半萜

秦天麗，陳彥伍，吳石麗，張 凡，李明明，何紅平,

1云南中醫藥大學中藥學院；2云南中醫藥大學民族醫藥學院，昆明 650500

山楝Aphanamixispolystachya是楝科(Meliaceae)山楝屬(Aphanamixis)植物，在我國主要分布于廣東、廣西、云南等地區[1,2]。山楝屬植物始載于《新華本草綱要》，其味辛，性溫。歸肝、腎經，主治風寒痹癥、屈伸不利、拘攣、四肢麻木等癥狀[3]。山楝之所以備受關注，是源于其種子、樹皮、葉子、果實等作為植物藥在民間的廣泛使用[4]。目前已有文獻報道山楝中化學成分主要包括檸檬苦素類衍生物、三萜、二萜、倍半萜和甾體等化合物[5-9]。活性研究表明，該種分離得到的化合物具有殺蟲、抗腫瘤、抗炎等生物活性[9-12]。前期我們課題組對楝科山楝屬植物的化學成分進行了系列研究和報道[13-16]，近期本課題組對山楝枝葉展開了化學成分研究工作，從其95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分離得到了9個化學成分。本文詳細介紹了9個化合物的分離純化、結構鑒定和生物活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance NEO 400 MHz型超導核磁共振儀(德國Bruker公司)；Agilent 1260 infinity 液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；半制備柱Zorbax SB-C18柱(5 μm，9.6 mm×250 mm)；美國Agilent UPLC/Q-Tof液質聯用儀；JASCO P-1020旋光儀；Bio-Rad FTS-135紅外光譜儀；島津紫外-2401PC分光光度計(日本東京島津)；Sephadex LH-20(40～70 μm，Amersham Pharmacia Biotech AB)；硅膠(80-100目和100～200目)；試驗中所用試劑均為分析純或色譜純。

山楝枝葉于2017年11月采自云南省西雙版納，由昆明植物所陳瑜老師鑒定為山楝屬植物山楝Aphanamixispolystachya的干燥枝葉。標本現存于云南中醫藥大學民族中藥質量標準重點實驗室，保存編號為H20171105。

1.2 提取與分離

將21 kg干燥的山楝枝葉粉碎，用5倍體積的95%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，所得提取液減壓濃縮至無醇味，得總浸膏2.6 kg。浸膏用蒸餾水溶解后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，分別得到石油醚部分0.7 kg和乙酸乙酯部分1.3 kg。

乙酸乙酯部分經硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮(50∶1→6∶4)及氯仿-甲醇(10∶1→0∶1)體系進行梯度洗脫，TLC檢測合并后得到8個組分Fr.1～8。其中Fr.1經MCI柱色譜，甲醇/水(9∶1)脫除色素，再經硅膠柱色譜，石油醚-丙酮梯度(梯度情況)洗脫，得到四個組分Fr.1-1～Fr.1-4。 Fr.2經RP-18色譜柱分段(甲醇-水，20%→100%)，以及Sephadex LH-20柱(甲醇)和HPLC半制備分離，以乙腈/水(48∶52)為流動相(tR= 34 min)，得到化合物3(12 mg)，以乙腈/水(69∶31)為流動相(tR= 32 min)，得到化合物4(27 mg)。Fr.3經RP-18色譜柱分段(甲醇-水，20%→100%)，得四個組分(Fr.3-1～Fr.3-4)，Fr.3-2經RP-18色譜柱和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱分離得到化合物5(236 mg)。Fr.3-3經Sephadex LH-20(甲醇)柱純化得到化合物9(135 mg)。Fr.4 經硅膠柱層析和重結晶純化，得到化合物6(136 mg)，剩余部分再經Sephadex LH-20柱(甲醇)和HPLC半制備得到2(10 mg，乙腈/水，58∶42，tR= 34 min)、1(8 mg，乙腈-水，58∶42，tR= 36 min)。 Fr.5經MCI柱色譜，甲醇/水(9∶1)脫除色素，再經RP-18色譜柱分段(甲醇-水，10%→100%)，得到得5個組分(Fr.5-1～Fr.5-5)。Fr.5-2經硅膠，Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱色譜后得到化合物7(150 mg)和化合物8(86 mg)。

1.3 活性測試

采用脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞RAW 264.7模型評價化合物抑制NO產生的活性[17,18]。實驗以NG-單甲基-L-精氨酸乙酸鹽(L-NMMA)作陽性對照，設置空白組、模型組(LPS組)、溶劑組(DMSO組)、溶劑模型(DMSO+LPS)、陽性藥物組(LPS+L-NMMA)和化合物實驗組。RAW264.7細胞在37 ℃，CO2濃度為5%的培養條件下接種于96孔細胞培養板(1.5×105細胞/孔)，培養24 h。在實驗組化合物以梯度變化，分別加入100、50、25、12.5和6.25 μg/mL的待測樣品，孵育1 h后加入20 μL LPS作用18 h。收集上清，用Griess法檢測細胞上清液中NO水平。同時用MTS法評價RAW264.7細胞的存活率，以消除受試化合物細胞毒性的干擾。

2 結果與討論

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1～9的化學結構Fig.1 Structures of compounds 1-9

表1 化合物1和2的1H NMR和13C NMR數據(CDCl3)Table 1 NMR spectral data of compounds 1 and 2 in CDCl3

圖2 化合物1和2的主要1H-1H COSY和 HMBC相關Fig.2 1H-1H COSY and HMBC correlations of 1 and 2

化合物7白色粉末；C7H6O4，ESI-MS：m/z155 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.34(1H，br s，H-2)，6.69(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，7.32(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：123.4(C-1)，115.9(C-2)，145.2(C-3)，151.7(C-4)，124.0(C-5)，117.9(C-6)，170.4(COOH)。其波譜數據與文獻報道一致[23]，故鑒定其為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物8白色粉末；C9H8O5，ESI-MS：m/z181 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.24(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)，7.55(1H，d，J= 16.0 Hz，H-3)，7.06(1H，d，J= 2.0 Hz，H-5)，6.94(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J= 8.0 Hz H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：170.0(C-1)，116.4(C-2)，146.9(C-3)，127.7(C-4)，115.0(C-5)，146.6(C-6)，149.3(C-7)115.4(C-8)，122.7(C-9)。其波譜數據與文獻報道一致[24]，故鑒定其為反式咖啡酸。

2.2 活性測試結果

對新化合物活性測定結果顯示，化合物1和2抑制NO生成的IC50值分別為1 162.0和259.3 μg/mL(陽性對照L-NMMA的IC50為14.7 μg/mL)，對脂多糖誘導的RAW 264.7細胞NO生成沒有表現出明顯的抑制活性。

3 結論

本實驗通過對山楝枝葉的化學成分進行研究，從中分離得到了9個化合物，包含倍半萜、二萜和酚酸類成分。化合物1和2為兩個新的含有十元環結構的倍半萜，其生源上可能是由愈創木型倍半萜1,5-開環得來。化合物4、7、8和9為從該植物中首次分離。迄今為止，從山楝中分離的化學成分主要為檸檬苦素類化合物和一些鏈狀二萜類成分[5-8,14,15]，倍半萜、半日花烷型二萜類和酚酸成分報道較少，本研究豐富了山楝中化學成分的結構類型，為山楝的資源化利用提供理論基礎。