毒根斑鳩菊中的一個新倍半萜的分離與鑒定

王盈盈，王開明，周鳳玲，周曉婭，鐘惠民

1濟寧醫學院基礎醫學院；2山東理工職業學院化工新材料工程學院，濟寧272067；3青島科技大學化學與分子工程學院，青島 266042

毒根斑鳩菊VernoniacumingianaBenth為菊科Compositae管狀花亞科斑鳩菊族斑鳩菊屬植物，又名驚鳳紅、過山龍、細脈斑鳩菊等，在我國主要產于廣西西部和西南部、福建、四川、云南、臺灣等地區，常攀在喬木上。該屬植物有1 000多種，其中有許多種可供藥用，在我國就有12種作為藥用植物。目前對斑鳩菊屬植物的化學成分和生物活性研究較多，研究表明其化學成分復雜多樣。目前對該屬植物藥理活性的研究已不只停留在粗提物的研究上，近年主要對該屬植物的某些單體成分進行研究，尤其是倍半萜內酯類化合物和甾體皂苷類化合物也是近年來研究的熱點。倍半萜是植物揮發油中高沸點部分的主要組成部分，倍半萜的含氧衍生物多有較強的香氣和生物活性，是醫藥、食品、化妝品工業的主要原料，而倍半萜內酯類大多具有細胞毒性和抗癌活性。由于倍半萜類化合物具有較強的藥理活性和結構骨架的多樣性，長期吸引著眾多學者的研究興趣，研究顯示倍半萜類化合物藥理活性廣泛。具有抗瘧[1]、抗腫瘤活性[2，3]、細胞毒[4]、抑菌[5]、抗炎止痛等作用[6，7]。此外，該屬中許多植物還具有殺蟲、抗瘧作用，尤其在美洲，斑鳩菊屬植物作為驅蟲、抗瘧疾的植物藥其療效顯著[8]。據記載此種的干根或莖藤可治風濕痛、腰肌勞損、四肢麻痹等癥，亦可用于感冒、發熱等[9]。斑鳩菊屬植物在我國資源豐富，目前對毒根斑鳩菊植物的化學成分和藥理活性研究還不夠深入，存在著廣闊的開發空間，尤其對毒根斑鳩菊植物的莖葉研究少之又少，因此，有必要對該植物進行更深入系統的研究，為其建立完善的質量標準。

本文對毒根斑鳩菊葉莖的95%乙醇提取物中的乙酸乙酯萃取部分進行了分離純化，旨在豐富該植物的化學成分研究。對分離得到的新倍半萜內酯化合物進行了抗菌活性測定。為毒根斑鳩菊的進一步開發利用提供了科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

柱層析硅膠H(75～150、45～75 μm)、硅膠板(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Merck公司)；循環水多用真空泵(SHB-3型,上海亞榮盛華儀器廠)；旋轉蒸發儀(E-52型，上海亞榮生化儀器廠)；顯微熔點儀(SGW X-4型，上海精密儀器有限公司)；Buchi中壓制備色譜儀(653型，瑞士Buchi公司)；核磁共振儀(Bruker Avance 500型，德國Bruker公司)；質譜儀(Agilent Technology 5975C)；單晶衍射儀(Bruker SMART-1000 CCD diffractomter XD-3型X射線單晶衍射儀，XRD，德國Bruker公司)。試劑均為國產分析純。

革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌Escherichiacoli、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis傷寒桿菌Salmonellaenterica)；革蘭氏陽性細菌(金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)作為檢測菌種，以上菌種均為本實驗室保存種。

大腸桿菌培養基、金黃色葡萄球菌培養基、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌所用培養基為營養肉湯和營養瓊脂。營養肉湯、營養瓊脂(杭州百思生物技術有限公司)；青霉素鉀與慶大霉素(百靈威科技有限公司)。

本實驗所用毒根斑鳩菊葉莖樣品于2019年1月采自于海南省昌江黎族自治縣，由青島科技大學化學與分子工程學院鐘惠民教授鑒定。憑證樣品(No.2019DGBJJ)保存于濟寧醫學院分子醫學與化學實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取和分離

準確稱取毒根斑鳩菊葉莖干樣15 kg粉碎后用95%乙醇加熱提取3次，每次5 h。合并提取液，過濾，將濾液于50 ℃以下減壓濃縮，得到浸膏192 g。用蒸餾水將其分散成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取(1 500 mL×3)，將萃取液合并后減壓濃縮，得到各組分浸膏分別為：35、26、61 g。將乙酸乙酯提取物浸膏(26 g)經反復硅膠柱色譜(石油醚-丙酮梯度洗脫100∶1→2∶1)分得6個流份(Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6)。流份Fr2依次經Sephadex LH-20凝膠色譜(95%乙醇)和硅膠柱色譜(石油醚-丙酮，體積比為20∶1→6∶1)分離，得到化合物2(12.5 mg)、3(9 mg)。流份Fr3依次經過Sephadex LH-20凝膠色譜(95%乙醇)和硅膠柱色譜(石油醚-丙酮，體積比為10∶1→1∶1)分離，得到化合物4(6.5 mg)。流份Fr4依次經過Sephadex LH-20凝膠色譜(95%乙醇)和硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，體積比為30∶1→10∶1)分離，得到化合物5(7.6 mg)、6(9.8 mg)。流份Fr5依次經過中壓色譜柱和硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，體積比為10∶1→3∶1)分離，得到化合物7(5.2 mg)。流份Fr6依次經過Sephadex LH-20凝膠色譜(95%乙醇)和硅膠柱色譜(石油醚-丙酮，體積比為6∶1→2∶1)分離，得到化合物1(11.5 mg)。

1.2.2 抗菌活性測定

本實驗采用雙層瓊脂擴散法對化合物1進行抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌4種菌株活性的測定，以青霉素鉀與慶大霉素作為陽性對照。將所用菌群活化后并調整菌體濃度為1×106CFU/mL。于無菌平皿中倒入10 mL的1.5%的素瓊脂，待其凝固后用無菌鑷子取滅菌的牛津杯(直徑8 mm)數個，按一定次序整齊排列于平皿中。取50 μL活化好的菌群懸液加入到15 mL冷卻至50 ℃左右的半固體牛肉膏蛋白胨培養基中，迅速混勻，將混合均勻的培養基傾倒于底層素瓊脂上，待其充分冷卻凝固后，以無菌鑷子取出牛津杯，即形成若干孔洞。配制無菌化合物1溶液(1 mg/mL)，按照順時針方向依次在牛津杯中加入120 μL抑菌液，以雙抗作陽性對照。超凈工作臺上放置2 h后，置37 ℃恒溫箱培養過夜，觀察是否出現抑菌圈，出現抑菌圈的用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結構鑒定

2.1 化合物1的結構鑒定

2.1.1 晶體結構測試

選取合適尺寸的化合物1單晶，放于X射線單晶衍射儀上，用經過石墨單色器單色化的MOKα射線(λ= 0.710 73)作為光源，于293(2)K溫度下，經φ-ω掃描方式，在一定角度范圍內收集所有衍射點，選取I > 2σ(I)的一定數量獨立衍射點用于結構的測定與修正，數據經Lp因子及半經驗吸收校正，所有計算經SHELXL97程序解出，非氫原子坐標和各向異性溫度因子經全矩陣最小二乘法對F2修正，晶體結構由直接法和Fourier合成法解出。

2.1.2 晶體結構解析

化合物1在2.55° ≤ θ ≤ 25.02° 范圍內共收集3 001個衍射點，其中2 105 [R(int)= 0.033 9]個獨立衍射點，精修參數為237個，最終偏差因子R1 = 0.044 9，wR2 = 0.087 5，最大殘余峰為0.172 e.A^-3，最小殘余峰為-0.168 e.A^-3。該化合物屬于單斜晶系，波長：Mo Kαradiation(0.710 73?)，Mw = 360.35，溫度：293(2)K，尺寸：0.34 mm×0.25 mm×0.20 mm，空間群為P2(1)，CCDC號：959512，晶體學參數為：a = 10.169 3(7)，b = 7.819 6(6)，c = 11.002 8(8)，α= 90°，β= 98.325 0(10)°，γ= 90°，晶體密度為：21.382 mg/m3，化合物的不飽和度為：Ω = 10。通過X射線晶體分析確定了該化合物的相對構型為3R*、4R*、12S*。該化合物的晶體結構及堆積圖如圖1所示。

圖1 化合物1的晶體結構及堆積圖Fig.1 Crystal structure and packing diagram of 1

2.1.3 波譜解析

由H-H COSY得出氫原子相關信號H-5(δH6.55)-H-4(δH5.78)-H-3(δH3.02)-H-12-(δH4.98)-H-11(δH2.76，3.02)和H-7(δH2.46，2.92)-H-8(δH2.46，3.02)-H-9(δH6.71)推導出化合物含有=CH-CH-O-與CH2=C(CH)-CH-O-片段。HMBC相關顯示H-3與C-5(δc149.8)、C-13(δc127.6)、C-1(δc169.1)，H-4與C-6(δc141.1)、C-12(δc71.8)、C-2(δc134.9)，H-5與C-7(δc21.6)、C-14(δc195.8)，H-7與C-9(δc141.1)、C-14(δc195.8)，H-9與C-15(δc194.9)、C-11(δc26.5)，H-11與C-15(δc194.9)、H-12與C-10(δc139.3)，H-13與C-1(δc169.1)相關。化合物1的關鍵HMBC和H-H COSY相關圖(見圖2)這些相關性表明該化合物具有gemacrane型碳骨架。與已知化合物4′-hydroxypectorolid[10]相比兩個羥基氧化成了兩個醛基，HMBC中得知H-12同C-16(δc164.9)相關確定該化合物的結構為2-hydroxy methyl acryl acid，經文獻檢索該化合物為一新化合物，命名為vernone A，其核磁共振氫譜與碳譜數據見表1。化合物1的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的關鍵HMBC和H-H COSY相關圖Fig.2 Key HMBC and H-H COSY correlation diagram of compound 1

表1 化合物1的1H和13C譜數據Table 1 1H and 13C NMR data of 1(500 and 125 MHz in DMSO)

2.2 化合物2～7結構鑒定

化合物2白色片狀結晶；mp.136 ℃；分子式C29H48O；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.05(1H，m，H-7)，5.16(1H，dd，J= 14.8，8.4 Hz，H-22)，5.24(1H，dd，J= 15.2，8.4 Hz，H-23)，3.62(1H，m，H-3)，0.56(3H，s，CH3-18)，0.79(3H，s，CH3-19)，0.83(3H，d，J= 7.2 Hz，CH3-27)，0.83(3H，t，J= 7.2 Hz，CH3-29)，0.85(3H，d，J= 6.4 Hz，CH3-26)，1.05(3H，d，J= 6.4 Hz，CH3-21)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.2(C-1)，31.6(C-2)，71.3(C-3)，38.2(C-4)，40.1(C-5)，29.6(C-6)，117.6(C-7)，139.6(C-8)，49.4(C-9)，34.3(C-10)，21.5(C-11)，39.6(C-12)，43.3(C-13)，55.2(C-14)，23.0(C-15)，28.5(C-16)，55.9(C-17)，12.3(C-18)，13.0(C-19)，40.8(C-20)，21.2(C-21)，138.2(C-22)，129.5(C-23)，51.2(C-24)，31.9(C-25)，21.5(C-26)，19.2(C-27)，25.4(C-28)，12.1(C-29)。以上數據與文獻[11]報道的數據一致，故鑒定化合物2為α-菠甾醇。

化合物3白色針狀結晶(氯仿)；mp.140～142 ℃；Libermann-Burchard 反應呈陽性；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：5.35(1H，s，H-6)，3.55(1H，m，H-3)，2.28(2H，m，H-4)，2.00(2H，s，H-7)，1.65(1H，m，3-OH)；13C NMR(500 MHz，CDCl3)δ：37.3(C-1)，31.5(C-2)，72.3(C-3)，42.2(C-4)，140.9(C-5)，120.9(C-6)，31.6(C-7)，32.0(C-8)，49.9(C-9)，36.2(C-10)，20.9(C-11)，39.1(C-12)，41.8(C-13)，56.8(C-14)，24.2(C-15)，27.7(C-16)，55.9(C-17)，11.9(C-18)，19.6(C-19)，39.5(C-20)，21.2(C-21)，31.1(C-22)，23.2(C-23)，29.5(C-24)，29.9(C-25)，20.3(C-26)，19.2(C-27)，23.6(C-28)，12.2(C-29)。以上波譜數據與文獻數據[12]報道基本一致，故鑒定化合物3為β-谷甾醇。

化合物4淡黃色結晶；mp.228 ℃；ESI-MS：m/z269 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，DMSO)δ：12.96(1H，s，5-OH)，10.77(1H，s，7-OH)，10.46(1H，s，4′-OH)，7.90(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，6′)，6.97(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3′，5′)，6.78(1H，s，H-3)，6.47(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J= 1.5 Hz，H-6)；13C NMR(500 MHz，DMSO)δ：183.1(C-4)，165.2(C-2)，165.2(C-7)，163.4(C-5)，162.1(C-4′)，158.7(C-9)，129.2(C-2′，6′)，123.2(C-1′)，117.0(C-3′，5′)，105.3(C-10)，104.2(C-3)，99.7(C-6)，94.8(C-8)。以上數據與文獻[13]報道的芹菜素數據吻合，故鑒定化合物4為芹菜素。

化合物5黃色粉末；mp.262 ℃；分子式C16H12O7；ESI-MS：m/z315 [M-H]-：1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：12.80(1H，s，5-OH)，7.71(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.58(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6′)，7.01(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.49(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.25(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，3.86(1H，s，4′-OCH3)；13C NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：178.7(C-4)，164.1(C-7)，162.4(C-9)，156.9(C-5)，155.9(C-4′)，148.3(C-2)，144.9(C-3′)，138.5(C-3)，122.2(C-1′)，121.2(C-6′)，115.5(C-2′)，115.4(C-5′)，104.0(C-10)，98.5(C-6)，93.6(C-8)，59.3(4′-OCH3)。上述數據與文獻[14]所報道的檉柳素數據吻合，因此確定該化合物為檉柳素。

化合物6白色晶體；mp.194 ℃；分子式為C30H50O；EI-MS：m/z426 [M]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.22(1H，dd，J= 10.5，5.0 Hz，H-3)，5.31(1H，d，J= 6.3 Hz，H-11)，0.97(3H，s，H-23)，0.87(3H，s，H-24)，1.07(3H，s，H-25)，0.74(3H，s，H-26)，0.82(3H，s，H-27)，0.76(3H，s，H-28)，0.90(3H，d，J= 6.5 Hz，H-29)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(500 MHz，CDCl3)δ：39.2(C-1)，28.1(C-2)，79.1(C-3)，39.2(C-4)，44.2(C-5)，17.9(C-6)，19.1(C-7)，39.9(C-8)，150.9(C-9)，37.6(C-10)，116.1(C-11)，36.7(C-12，13)，37.7(C-14)，29.2(C-15)，36.1(C-16)，42.9(C-17)，51.9(C-18)，20.1(C-19)，28.1(C-20)，59.6(C-21)，30.7(C-22)，27.4(C-23)，14.9(C-24)，25.2(C-25)，15.3(C-26)，15.8(C-27)，13.9(C-28)，22.1(C-29)，22.9(C-30)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物6為羊齒烯醇。

化合物7淺褐色油狀物；ESI-MS：m/z177 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.65(1H，d，J= 8.0 Hz，-CHO)，7.41(1H，d，J= 16.0 Hz，H-3)，7.14(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-5′)，7.08(1H，d，J= 2.0 Hz，H-3′)，6.97(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6′)，6.59(1H，dd，J= 16.0，7.5 Hz，H-2)，3.96(3H，s，2′-OCH3)。1H NMR數據與文獻[16]報道的4-羥基-2-甲氧基肉桂醛數據一致，在薄層板上以不同的展開體系與標準品對照其Rf值相同，濃硫酸顯色相同，樣品與標準品混合測熔點不下降，因而鑒定為4-羥基-2-甲氧基肉桂醛。

3 討論與結論

從毒根斑鳩菊葉莖乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分經硅膠和Sephadex LH-20層析柱分離得到了7個化合物，它們分別是vernone A(1)、α-波甾醇(2)、β-谷甾醇(3)、芹菜素(4)、檉柳素(5)、羊齒烯醇(6)、4-羥基-2-甲氧基肉桂醛(7)。其中化合物4～7是首次從該植物中提取得到，化合物1為一個新的倍半萜內酯化合物。抑菌結果顯示vernone A在實驗濃度范圍內對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及傷寒桿菌未表現出明顯抑菌作用。該倍半萜對所篩查的菌落抑菌作用不明顯，對該化合物的活性作用需進行進一步篩查。本文報道了其分離方法、結構鑒定、活性測定，為毒根斑鳩菊的綜合開發和利用提供了一定理論基礎和依據。

Vernone A為一個新的吉馬烷型倍半萜內酯，結構上首次發現含有兩個醛基的吉馬烷型倍半萜內酯，而吉馬烷型倍半萜是幾類倍半萜骨架的生物合成前體。由于結構特性，部分倍半萜具有較好的抗腫瘤、抗炎、抗瘧、殺蟲、抗病毒等生物活性。因此，基于倍半萜成分對斑鳩菊屬植物資源進行研究與開發利用將具有廣闊的前景。雖然目前對斑鳩菊屬植物中倍半萜類成分的研究取得了一定的進展，但是也存在一些不足。從得到的化學成分來看，研究目標主要在倍半萜，但多數倍半萜結構復雜，存在構象異構體和構型異構體，采用傳統色譜方法分離較為困難。在藥理活性方面，近年來研究[3,7,8]表明部分倍半萜化合物有較好的抗炎、抗瘧活性，并從信號通路、作用靶點上解釋了其抗炎機制，但是藥理活性的研究主要集中在單體化合物的體外活性篩選，而體內藥效評價、作用機制及構效關系的研究甚少，可能與化合物產量不夠無法深入研究有關。

鑒于此，今后對斑鳩菊屬藥用植物的深入研究與開發中，建議從以下幾點著手：①采用更先進的方法和手段從斑鳩菊屬植物中分離、鑒定更多的倍半萜類化合物，如LC-MS，UPLC-MS等；②對篩選得到的強活性倍半萜類化合物進行大量制備或合成，以便深入進行體內藥效評價及機制靶點的研究；③研究顯示不少倍半萜有極好的抗腫瘤效果，迄今為止，自斑鳩菊屬分離得到的倍半萜內酯類化學成分具有極好的抗瘧、抗腫瘤活性，可利用構效關系研究，對倍半萜類成分進行結構修飾，開發更適于臨床的抗腫瘤藥物。此外，斑鳩菊屬植物在我國資源豐富，目前該屬植物的化學成分和藥理活性研究還不夠深入，存在廣闊的開發空間。因此有必要對該屬植物進行更深入系統的研究，為其建立完善的質量標準。