白藜蘆醇通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡抑制宮頸癌的研究

孫曉東，周 珍，曾 煉，謝麗霞，杜凱麗，桑 明,2*

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，襄陽(yáng) 441000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442000

白藜蘆醇(resveratrol，RES)，是一種非黃酮類的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生等植物以及虎杖等中藥材，作為低毒性的天然藥物發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，此外，白藜蘆醇也是一種很有前景的抗腫瘤藥物[1-3]。它的靶點(diǎn)廣泛，如mTOR、JAK、β-amyloid、Adenylyl cyclase、IKKβ、DNA polymerase，也是一種特異性的SIRT1活化劑和有效的孕烷X受體(PXR)抑制劑[4,5]。新近研究發(fā)現(xiàn)，RES對(duì)多種腫瘤具有體內(nèi)外抑制活性[6-9]，但RES作為一種抗癌藥物的臨床試驗(yàn)還是很有限，在腫瘤動(dòng)物模型中測(cè)試RES的研究結(jié)果表明，RES對(duì)胃腸道腫瘤主要發(fā)揮預(yù)防作用。而在乳腺癌動(dòng)物模型中RES有可能成為癌癥治療劑，然而，這種有益作用取決于動(dòng)物和細(xì)胞類型[10]。RES對(duì)于人類HPV病毒感染的宮頸癌模型發(fā)揮什么樣的作用，相關(guān)報(bào)道較少。本研究主要利用HeLa細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤，檢測(cè)RES在體內(nèi)的抑癌效應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)RES在宮頸癌細(xì)胞自噬方面發(fā)揮的作用，從體內(nèi)外兩方面探討RES通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡抑制宮頸癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)及研究所用的DMEM(11965-092)、胰酶(25300054)(Gibco公司，美國(guó))；二甲基亞砜(DMSO，D2650)、Trizol試劑(93289-100ML)(Sigma公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄酶(M1705)、RNA酶抑制劑(N2511)(Promega公司，美國(guó))；SYBR Green PCR Mix(1725204)(Bio-Rad公司，美國(guó))；Rabbit Anti-LC3 Polyclonal Antibody(abs127815)、Rabbit anti-p62/SQSTM1 Polyclonal Antibody(abs143300)、Rabbit Anti-TMEM49 Polyclonal Antibody (abs126424)、Rabbit Anti-Beclin 1 Polyclonal Antibody(abs122672)(愛(ài)必信生物科技有限公司，中國(guó))；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(C0003)、Ad-GFP-LC3B(C3006-1ml)、Ad-mCherry-p62(C3016-1ml)、Ad-mCherry-GFP-LC3B(C3011-1ml)、Mito-Tracker Red CMXRos(C1049-50 μg)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(A0208)、山羊抗小鼠二抗(A0216)(碧云天生物科技有限公司，中國(guó))；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國(guó))；Ⅸ70倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；ABI 7500-PCR儀(Life technology公司，美國(guó))；BD FACSAria II流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c裸小鼠，6周齡，雌性，體重18～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)公司[SCXK(湘)2019-0004]，在本實(shí)驗(yàn)室無(wú)特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間【SCXK(鄂)2017-0093】飼養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(審批號(hào)：20170622)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及腫瘤細(xì)胞株

18只Balb/C nude鼠，均于右側(cè)腋中線皮下注射瘤細(xì)胞(2×107/mL，100 μL/只)，每三天測(cè)量并根據(jù)公式(V= a×b2/2)計(jì)算瘤體的體積，做記錄，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行稱重。瘤體直徑大于2 mm視為成瘤，將小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、RES治療組(50 mg/kg)、RES治療組(100 mg/kg)，每組6只。RES治療組采用灌胃給藥，對(duì)照組給予等體積含相同濃度溶劑的生理鹽水。每天給藥一次，連續(xù)給藥三周。給藥期間觀察各組小鼠的精神、活動(dòng)、飲食、飲水情況。給藥三周后處死全部裸鼠。

HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞，HPV18陽(yáng)性)、SiHa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞，HPV16陽(yáng)性)、End1/E6E7細(xì)胞購(gòu)自湖南豐匯生物科技有限公司，通過(guò)STR鑒定，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11,12]。培養(yǎng)于高糖DMEM，添加10%胎牛血清，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)LC3B、Beclin-1和P62蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)

取腫瘤組織，4%多聚甲醛固定、石蠟包理，5 μm連續(xù)切片。采用免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中LC3B、Beclin-1和P62蛋白的表達(dá)，陽(yáng)性染色呈棕黃色，先在低倍鏡下掃視整個(gè)組織切片，在細(xì)胞染色清晰，背景良好的區(qū)域選擇4個(gè)視野，進(jìn)行高倍鏡拍照，用Image J軟件讀取4個(gè)視野的陽(yáng)性面積，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Real-time RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá)

HeLa細(xì)胞用不同濃度RES(10、20、40 μM)、Rapa處理24 h，采用TRIzol試劑提取總RNA，合成 cDNA，用SYBR Green PCR Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，然后95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熔解曲線檢測(cè)引物特異性。以GAPDH作為內(nèi)參照，2-△△CT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由金凱瑞生物科技有限公司合成(武漢)，序列如下表1。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.4 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

HeLa細(xì)胞同“1.2.3”處理，用預(yù)冷的PBS清洗培養(yǎng)板的細(xì)胞，加蛋白裂解液冰上提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后加樣緩沖液混合，100 ℃煮5 min。在12% SDS-PAGE電泳膠中電泳分離，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗、二抗，以GAPDH為內(nèi)參照，用ECL發(fā)光法顯色，用Bio-Rad成像設(shè)備曝光采圖，Image Lab軟件讀取條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 腺相關(guān)病毒Ad-GFP-LC3B、Ad-mCherry-p62、Ad-mCherry-GFP-LC3B感染HeLa細(xì)胞

HeLa細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞爬片上，每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h完全貼壁后，換800 μL新鮮培養(yǎng)液，按照美國(guó)CDC的生物安全等級(jí)及其操作與防護(hù)要求進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，每孔以MOI值為5進(jìn)行腺病毒感染，感染后約24 h，除去含有病毒的培養(yǎng)液，每孔加入1 mL新鮮的完全培養(yǎng)液，按照分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用Hoechst染細(xì)胞核，PBS清洗后，取出細(xì)胞爬片，扣于有封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及熒光蛋白表達(dá)情況，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞自噬水平。

1.2.6 JC-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)△Ψm的理想熒光探針。在△Ψm較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光；在△Ψm較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。△Ψm的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到△Ψm的下降，同時(shí)也可以作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。將HeLa和SiHa細(xì)胞分為對(duì)照、RES、自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)、自噬抑制劑巴伐洛霉素A1(bafilomycin A1，BAFA1)、RES+Rapa、RES+BAFA1，共6組，RES工作濃度為40 μM，Rapa工作濃度為100 nM，BAFA1工作濃度為100 μM。處理24 h，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，直接用1 mL JC-1染色工作液孵育細(xì)胞，或用0.25%的胰酶消化后收集細(xì)胞，用1mL JC-1染色工作液充分混勻，37 ℃ 孵育15 min，根據(jù)試劑說(shuō)明，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光) 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HeLa按照“1.2.6”方法處理24 h，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS洗滌一次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min，用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，TdT酶與熒光標(biāo)記液按1∶9配制，每孔細(xì)胞加TUNEL檢測(cè)液50 μL，室溫避光孵育60 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RES顯著抑制裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)

用藥期間，每組裸鼠進(jìn)食、飲水、體重及活動(dòng)狀況良好，未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。與對(duì)照組相比，RES(50 mg/kg)和RES(100 mg/kg)治療組腫瘤大小和質(zhì)量明顯低于Vehicle組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1a和1b。

2.2 RES顯著促進(jìn)腫瘤組織中LC3B和Beclin-1表達(dá)、抑制P62表達(dá)

免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中LC3B、P62和Beclin-1蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示RES可以上調(diào)LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平同時(shí)下調(diào)P62蛋白表達(dá)水平，且有一定的濃度依賴。結(jié)果如圖1c所示。這提示RES抑制宮頸癌生長(zhǎng)可能與促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。

圖1 RES抑制宮頸癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)Fig.1 RES inhibits the growth of cervical cancer subcutaneous xenografts in nude mice注：(a)HeLa細(xì)胞裸鼠皮下移植腫瘤生長(zhǎng)體積；(b)HeLa細(xì)胞裸鼠皮下移植腫瘤重量，與Vehicle組相比較，**P < 0.01，***P < 0.001；(c)腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin-1和LC3B(標(biāo)尺：20 μm)。Note:(a)The tumor volume;(b) The tumor weight,compared with vehicle,**P <0.01,***P <0.001.(c) The autophagy-related protein levels of P62,Beclin-1,and LC3B in tumor tissue was detected using immunohistochemical (Scale bar:20 μm).

2.3 RES調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)

為證實(shí)RES是否調(diào)控宮頸癌細(xì)胞自噬，我們通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)基因VMP1、Beclin-1和P62的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示RES可以顯著促進(jìn)自噬基因VMP1、Beclin-1的表達(dá)，顯著抑制P62的表達(dá)，與自噬激活劑Rapa的效果相似，其中40 μM RES與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如圖2a所示。Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示RES促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白VMP1、Beclin-1和LC3B的表達(dá)，如圖2b所示。Ad-GFP-LC3B和Ad-mCherry-p62感染細(xì)胞后，熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，RES抑制P62的表達(dá)，促進(jìn)LC3B的表達(dá)，如圖2c所示。

圖2 RES促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞自噬Fig.2 RES promotes autophagy of cervical cancer cells注：(a)Real-time RT-PCR檢測(cè)HeLa細(xì)胞中VMP1、Beclin-1、P62 mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組比，*P < 0.05；(b)Western blotting檢測(cè)HeLa細(xì)胞中VMP1、Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)水平；(c)Ad-GFP-LC3B和Ad-mCherry-p62感染細(xì)胞后，熒光顯微鏡檢測(cè)小體(標(biāo)尺：20 μm)。Note:(a)The expression levels of VMP1,Beclin-1,P62 mRNA in HeLa cells was detected using Real-time RT-PCR,compared with the control group, *P <0.05;(b) The protein levels of VMP1,Beclin-1,LC3B in HeLa cells was detected using Western blotting;(c)RES inhibited the expression of P62 and promoted the expression of LC3B,increased the number of autophagosomes (Scale bar:20 μm).

2.4 RES促進(jìn)HeLa細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬

為檢測(cè)RES誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是否與線粒體損傷相關(guān)，在感染 Ad-GFP-LC3B后，RES、Rapa、BAFA1單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞24 h后，再用Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記線粒體，然后用熒光顯微鏡檢測(cè)拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP-LC3B標(biāo)記的自噬小體增加伴隨Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記的線粒體的減少，如圖3a所示。因?yàn)锽AFA1抑制自噬小體的酸化，所以RES與BAFA1聯(lián)合組自噬小體累積明顯(圖3a)。而P62蛋白在RES組、Rapa組、RES + Rapa組都明顯降低，BAFA1組、BAFA1 + RES組沒(méi)有明顯變化(圖3b)，這也說(shuō)明BAFA1或者BAFA1與RES聯(lián)用抑制自噬小體的降解。另外，為檢測(cè)RES對(duì)自噬流的影響，用雙熒光標(biāo)記的腺相關(guān)病毒載體Ad-mCherry-GFP-LC3B感染HeLa細(xì)胞，24 h后再用RES、Rapa、BAFA1單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞24 h，然后用熒光顯微鏡檢測(cè)拍照，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(lái)(LC3B dot or punctae)；當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(lái)。結(jié)果顯示RES促進(jìn)HeLa細(xì)胞自噬流的發(fā)生，RES組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)黃色斑點(diǎn)明顯增加，說(shuō)明自噬小體形成增多；RES + Rapa組比Rapa組紅色斑點(diǎn)增加，說(shuō)明自噬溶酶體增多；BAFA1組、RES + BAFA1組只有綠色熒光，而且綠色熒光有進(jìn)入細(xì)胞核的現(xiàn)象，如圖3c。這些提示RES促進(jìn)細(xì)胞自噬流的形成，而 BAFA1阻斷自噬流后RES不能再恢復(fù)自噬流。

圖3 RES對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響Fig.3 Effects of RES on autophagy of HeLa cells注：(a)Ad-GFP-LC3B標(biāo)記自噬小體,Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記線粒體，熒光顯微鏡觀察自噬小體的變化(標(biāo)尺：20 μm)；(b)Ad-mCherry-p62標(biāo)記P62，RES與Rapa、BAFA1處理HeLa細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡拍照(標(biāo)尺：20 μm)；(c)Ad-mCherry-GFP-LC3B檢測(cè)自噬流(標(biāo)尺：20 μm)。Note:(a) Ad-GFP-LC3B labeled autophagosomes,Mito-Tracker Red CMXRos labeled mitochondria,the changes of autophagosomes was observated by fluorescence microscope (Scale:20 μm);(b) Ad-mCherry-p62 labeled P62,RES and Rapa,BAFA1 treated HeLa cells for 24 h,the changes of autophagosomes was observated by fluorescence microscope (Scale:20 μm);(c) Autophagic flow of HeLa cells was detected by using Ad-mCherry-GFP-LC3B (Scale bar:20 μm).

2.5 RES抑制宮頸癌與降低△Ψm相關(guān)

JC-1檢測(cè)結(jié)果顯示RES，Rapa和BAFA1對(duì)宮頸癌細(xì)胞的△Ψm具有不同的影響，RES和BAFA1不同程度的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞(圖4a、c)和SiHa(圖4b、c)△Ψm降低，Rapa對(duì)△Ψm的影響不明顯(圖4a、b、c)； 與單獨(dú)使用RES組相比，同時(shí)使用RES和Rapa，△Ψm降低比例有所減少，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而同時(shí)使用RES和BAFA1組的細(xì)胞△Ψm降低更加顯著，如圖4a、b、c。△Ψm的降低，是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它可引起線粒體膜發(fā)生一連串的生物化學(xué)變化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此JC-1可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)，△Ψm下降的比例增加，也說(shuō)明發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞比例也增加。接下來(lái)，用TUNEL試劑檢測(cè)HeLa細(xì)胞各組處理后的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞凋亡比例的變化與△Ψm降低的比例基本一致，RES和BAFA1不同程度的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合使用后，細(xì)胞凋亡比例增加；Rapa對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯作用，與單獨(dú)使用RES相比，RES和Rapa聯(lián)合組細(xì)胞凋亡比例有所下降(如圖4d)。這些結(jié)果提示RES對(duì)線粒體膜電位以及細(xì)胞凋亡的作用在與BAFA1聯(lián)用后有疊加效應(yīng)，與Rapa聯(lián)用后有消減效應(yīng)，說(shuō)明RES對(duì)宮頸癌細(xì)胞的自噬和凋亡都有影響，自噬激活的情況下凋亡減弱，自噬抑制的情況下凋亡增強(qiáng)。

圖4 RES與Rapa、BAFA1誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡Fig.4 RES and Rapa,BAFA1 induce cervical cancer cell apoptosis注：(a)流式檢測(cè)RES與Rapa、BAFA1對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響；(b)流式檢測(cè)RES與Rapa、BAFA1對(duì)SiHa細(xì)胞線粒體膜電位的影響；(c)圖a和圖b結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；(d)熒光顯微鏡檢測(cè)RES與Rapa、BAFA1對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響。Note:(a) The effect of RES,Rapa,and BAFA1 on the mitochondrial membrane potential of HeLa cells;(b) The effect of RES,Rapa,and BAFA1 on the mitochondrial membrane potential of SiHa cells;(c) Statistical analysis of (a) and (b),compared with the control group,*P <0.05,**P <0.01;(d) The effect of RES,Rapa,and BAFA1 on apoptosis of HeLa cells was used by fluorescence microscopy.

3 討論

宮頸癌治療以手術(shù)為主，術(shù)后聯(lián)合化、放療。由于化療藥物大多具有較強(qiáng)的不良反應(yīng)和易產(chǎn)生耐藥性，限制了宮頸癌的臨床治療及預(yù)后，因而尋找抗瘤效果好而毒性低的藥物是臨床治療的緊迫需求。近年來(lái)的大量研究證實(shí)RES具有良好的抗腫瘤能力，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中均有功效[6,7,9,13]。研究證實(shí)，在宮頸癌細(xì)胞中組織蛋白酶L介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的自噬性和凋亡性細(xì)胞死亡[14]，白藜蘆醇誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞系的線粒體膜電位降低，促進(jìn)其凋亡的發(fā)生，也可以增加溶酶體通透性[15]。本研究進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了白藜蘆醇通過(guò)自噬途徑抑制宮頸癌的效應(yīng)，首先通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RES顯著抑制宮頸癌的進(jìn)展，而且，組織水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)受到RES的調(diào)節(jié)，因此推測(cè)RES抑制宮頸癌的機(jī)制可能與RES誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell death，ACD)的發(fā)生有關(guān)。ACD是細(xì)胞發(fā)生過(guò)度自噬的結(jié)果，也是與細(xì)胞凋亡不同的Caspase非依賴性的Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[16]，其主要特征為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量自噬體和自噬溶酶體，胞質(zhì)中絕大部分物質(zhì)被降解，但細(xì)胞核依然保持完整性[17]。在持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)及持續(xù)進(jìn)展的自噬作用下，細(xì)胞會(huì)由于過(guò)度的自我損耗而死亡[18]。這類細(xì)胞的死亡常常帶有自噬特征，主要表現(xiàn)為Beclin1的過(guò)表達(dá)以及細(xì)胞中產(chǎn)生大量自噬體和自噬溶酶體[19]。液泡膜蛋白(vacuole membrane protein-1，VMP1)是公認(rèn)的自噬蛋白，其表達(dá)水平與腫瘤惡性程度負(fù)相關(guān)[20]，與Beclin-1共同作為激活自噬的分子開(kāi)關(guān)[21]。VMP1在宮頸癌中的表達(dá)以及作用還未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)RT-PCR、Western blot以及自噬小體檢測(cè)均證實(shí)，RES促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞ACD的發(fā)生。結(jié)果顯示，在宮頸癌細(xì)胞中Beclin-1、VMP1以及位于自噬小體和自噬溶酶體內(nèi)膜的LC3B可以被RES誘導(dǎo)高表達(dá)，效應(yīng)與Rapa相似。Rapa是哺乳動(dòng)物TOR(mTOR)激酶的抑制劑，與FKBP12結(jié)合抑制mTORC1激活自噬，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[22,23]。進(jìn)一步檢測(cè)自噬小體及自噬流，發(fā)現(xiàn)RES和Rapa均可促進(jìn)自噬小體和自噬溶酶體的形成，兩者聯(lián)用后自噬小體和自噬溶酶體進(jìn)一步增加，伴隨P62和線粒體的減少，但細(xì)胞核仍保持完整；同時(shí)，我們觀察到BAFA1可阻斷RES造成的宮頸癌細(xì)胞的自噬流，BAFA1與RES聯(lián)用造成自噬小體和P62的累積，伴隨線粒體的顯著減少，而且細(xì)胞核明顯異常與其它組。BAFA1是一種從鏈霉菌屬物種中分離的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是特異的 vacuolar-type H+ ATPase(V-ATPase)抑制劑。BAFA1可以靶向線粒體，誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，促進(jìn)caspase非依賴性凋亡。此外，BAFA1誘導(dǎo)Beclin-1與Bcl-2結(jié)合，進(jìn)一步抑制自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位和TUNEL陽(yáng)性率，我們發(fā)現(xiàn)RES可以誘導(dǎo)線粒體膜電位下降促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而在自噬激活和自噬抑制的情況下會(huì)產(chǎn)生對(duì)宮頸癌細(xì)胞的不同反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，RES阻止Rapa誘導(dǎo)的P62降解，因此Rapa和RES的聯(lián)合能夠阻止自噬的上調(diào)并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[25]。但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RES和Rapa聯(lián)用可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞過(guò)度自噬，自噬溶酶體的大量形成造成ACD的發(fā)生；而當(dāng)宮頸癌細(xì)胞的自噬流被阻斷，RES又可通過(guò)降低線粒體膜電位誘導(dǎo)內(nèi)源性的細(xì)胞凋亡。

由此可見(jiàn)，RES在婦科腫瘤宮頸癌的治療方面有良好的應(yīng)用前景，而且與自噬激活劑Rapa或者自噬抑制劑BAFA1聯(lián)合使用，能從促進(jìn)自噬性死亡或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩個(gè)途徑起到更加積極的抗癌作用。