狹果茶藨子果實多糖提取及其抗氧化和流變特性

喬楊波，蔡庭秀，劉 哲，趙永珍，哈生云，葉 英,3*

1青海大學農牧學院，西寧 810016；2青海圣航農牧科技開發有限公司，尖扎 811200；3青海省青藏高原農產品加工重點試驗室，西寧 810016

狹果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim，RSM)屬虎耳草科茶藨子屬植物，生于海拔2 800 m以下的山坡灌叢、雜木林下或山溝中，是原產于起北歐的一種木本灌木。在中國主要分布于四川、甘肅、陜西、青海等地。全世界約有160種，中國有59種30變種，僅青海就有11種1個變種[1-3]?！毒е楸静荨分杏涊d茶藨子屬植物具有滋補止瀉、斂毒、除黃水之效，并能收斂各種脈管病，與樹莓、藍莓、山葡萄、沙棘等尚未被完全開發的野生山果一起并稱為第三代水果[4]。茶藨子屬植物中富含維生素C，總酚、黃酮、多糖、多糖等多種生物活性物質，具有多種生物活性，如調節腸道菌群平衡[5]，提高機體抗氧化能力，抑菌[6]等。同時還可降低患心血管疾病[3]、癌癥、神經退化性疾病、免疫系統疾病[5]、糖尿病、慢性風濕病、關節炎和炎癥性等疾病的風險[7]。

研究表明，植物源多糖具有較強的親水性[8]、較高的熱穩定性[9]以及優良的流變學性質[10]，致使其具有良好的加工性能，因而廣泛的應用于食品加工當中。同時因植物源多糖具有多種重要的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、降血糖，提高機體免疫力[11-14]等，因而在保健品和醫藥工業中也具有潛在的應用前景。青海地區狹果茶藨子資源豐富，但是均為野生狀態[4]。多糖作為狹果茶藨子果實中一類重要的生物活性物質，尚未見有關其研究的相關報道。本研究采用青海當地狹果茶藨子果實為原料，采用超聲輔助提取法，設計單因素試驗和響應面試驗對狹果茶藨子果實多糖提取工藝條件進行優化，具有提取時間短、操作簡單、原料利用率高、成本低廉等優點[15]。同時就提取后的狹果茶藨子果實多糖的體外抗氧化活性及流變特性予以探討，旨在從狹果茶藨子果實中開發新型的天然抗氧化劑和增稠劑，進一步擴大狹果茶藨子在食品領域當中的應用，發揮其潛在的生物價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹果茶藨子(采摘自青?；ブ楣锑l)；抗壞血酸、DPPH試劑(南京奧多福尼生物科技有限公司)；ABTS試劑(北京酷爾化學科技有限公司)；D101大孔吸附樹脂(東鴻化工有限公司)；無水乙醇、氯仿、正丁醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、苯酚等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4S數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市友聯儀器研究所)；SB-3200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HJ-4A數顯恒溫多頭磁力攪拌器(崢嶸儀器)；KC-130小型粉碎機(北京開創同和科技發展有限公司)；UV-2 600紫外可見分光光度計(島津企業管理有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；GS55-9冷凍干燥機(基因有限公司)；來美ETT CP 5000 流變儀(廣州來美科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 狹果茶藨子果實多糖的提取

狹果茶藨子果實干燥粉碎后過60目篩，去除籽粒。準確稱取一定量的果粉，按料液比1∶10加入95%的乙醇溶液靜置過夜。收集沉淀后在55 ℃烘箱中干燥。準確稱取干燥后的狹果茶藨子果實粉末，按料液比1∶30 g/mL，溫度40 ℃，時間30 min，對狹果茶藨子果實多糖進行超聲輔助提取。將提取后的多糖濾液濃縮至原體積的三分之一，按體積比3∶1加入Sevege試劑進行除蛋白處理，重復上述過程，直到無蛋白析出。使用D101大孔吸附樹脂對脫蛋白后的多糖溶液進行脫色，將脫色后溶液濃縮至原體積的三分之一，加入4倍體積的無水乙醇使多糖沉淀。在4 ℃冰箱中靜置過夜，對沉淀進行真空冷凍干燥即得狹果茶藨子果實粗多糖提取物(R.stenocarpumpolysaccharides，RPs)。

1.3.2 狹果茶藨子果實多糖提取量的計算

參考文獻[16]，采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線。以吸光值y與葡萄糖標準品濃度x(μg/mL)進行線性回歸，得回歸方程：y=0.057 2x-0.112，R2=0.999，并根據標準曲線計算樣品中多糖濃度，按公式計算多糖提取量。

式中：C為標準曲線查得得樣品多糖濃度(μg/mL)；V為多糖液體積(mL)；n為稀釋倍數；m為狹果茶藨子果實粉末質量(g)。

1.3.3 狹果茶藨子果實多糖提取工藝優化

1.3.3.1 狹果茶藨子果實多糖提取單因素試驗

準確稱取1.0 g狹果茶藨子果實粉末，以超聲輔助熱水浸提法對狹果茶藨子果實多糖進行提取，超聲功率為300 W。固定其他因素及相應水平，以狹果茶藨子果實多糖提取量為考察指標，研究提取溫度、時間、料液比對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響。設計各因素水平為：提取時間：20、30、40、50、60 min；料液比：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL。提取溫度：30、40、50、60、70 ℃。

1.3.3.2 狹果茶藨子果實多糖提取響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以狹果茶藨子果實多糖提取量為響應值(Y)，以提取溫度(A)、提取時間(B)、提取料液比(C)為試驗因素，利用Design-Expert 7.0.0軟件設計三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，并對結果進行分析。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Fctors and levels

1.3.4 狹果茶藨子果實多糖的流變特性研究

1.3.4.1 多糖濃度對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響

參考文獻[10]，將RPs配制成0.1%、0.5%、1.0%(W/V)的溶液，以0.1%(W/V)的羧甲基纖維素鈉溶液作為對照。設置剪切溫度為30 ℃，剪切速率掃描范圍為150～1 000 s-1，研究不同多糖濃度對表觀粘度的影響。

1.3.4.2 剪切溫度對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響

參考文獻[17]，將RPs配制成0.1%、0.5%、1.0%(W/V)的溶液，以0.1%(W/V)的羧甲基纖維素鈉溶液作為對照。設置剪切溫度范圍為30～80 ℃，剪切速率為500 s-1，研究剪切溫度對多糖表觀粘度的影響。

1.3.4.3 pH對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響

參考文獻[18]，以1.0%(W/V)RPs溶液為研究對象，用0.1 M HCl與0.1 M NaOH調節pH至3、7、11，設置剪切溫度為40 ℃，剪切速率掃描范圍為150～1 000 s-1，研究pH對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響。

1.3.5 狹果茶藨子果實多糖的抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參考文獻[19]，精確稱取DPPH，用無水乙醇將其配置為0.2 mM。精確稱取RPs，用蒸餾水將其稀釋到不同的質量濃度(1.00～0.03 mg/mL)，與上述DPPH溶液按體積比1∶1混合，室溫下避光靜置30 min后，在517 nm處測定吸光度值，以抗壞血酸為陽性對照，并按公式計算DPPH自由基清除率。

式中Asample為DPPH溶液的吸光值；Acontrol為樣品加DPPH溶液的吸光值。

1.3.5.2 羥自由基清除率測定

參考文獻[19]，精確稱取RPs，用蒸餾水將其稀釋到不同的質量濃度(1.00～0.03 mg/mL),精確吸取0.1 mL待測樣液，依次加入2 mL FeSO4(6 mM)與2 mL H2O2(6 mM)，混勻后在室溫下靜置10 min，加入2 mL水楊酸-乙醇溶液(6 mM)，于50 ℃水浴30 min后，在510 nm處測定吸光值，以抗壞血酸為陽性對照，按公式計算羥自由基清除率。

式中：A1為樣品吸光值；A2為不含H2O2時樣品的吸光值；A0為空白對照的吸光值。

1.3.5.3 總還原能力測定

參考文獻[19]，精確稱取RPs，用蒸餾水將其稀釋到不同的質量濃度(1.00～0.03 mg/mL),精確吸取0.5 mL待測樣液，依次加入2 mL 0.2 M pH 6.6 的PBS緩沖液與2.5 mL 1%(W/V)的K3Fe(CN)6，50 ℃水浴20 min，后加入2.5 mL 10%(W/V)三氯乙酸，3 000 rpm離心10 min后取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水與0.5 mL 0.1%(W/V)的FeCl3，室溫靜置10 min后于700 nm處測定吸光值。

1.4 數據處理

2 試驗結果

2.1 狹果茶藨子果實多糖提取單因素試驗結果

2.1.1 料液比對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響

固定提取時間40 min，提取溫度為40 ℃，研究料液比對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響，試驗結果見圖1。由圖1可知，當料液比為1∶30 g/mL時，狹果茶藨子果實多糖提取量達到最大值。此后隨著料液比的不斷增大，狹果茶藨子果實多糖提取量呈現下降趨勢。推測這可能是由于料液比的不斷增大，水分與狹果茶藨子果實粉末的濃度差越大，傳質驅動力越強，多糖可以有效的從原料中溶解出來。然而隨著料液比的進一步增大，此時由于多糖不斷從果實中溶出，溶劑的粘度也隨之加強，導致超聲波的空化效應減弱，也會降低多糖提取量。因此選取料液比1∶30 g/mL作為狹果茶藨子果實多糖最佳提取條件。

圖1 料液比對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the content of polysaccharides in R.stenocarpum

2.1.2 提取時間對對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響

固定提取溫度40 ℃，料液比1∶30 g/mL，研究提取時間對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響，試驗結果見圖2。由圖2可知，在提取時間為30 min時，狹果茶藨子果實多糖提取量達到最大值。此后隨著溫度的不斷上升，多糖提取量逐漸下降，推測這可能是由于提取時間過長導致多糖降解以及多糖分子結構的變化，致使多糖提取量降低。因此選取30 min作為狹果茶藨子果實多糖最佳提取時間以進行后續試驗。

圖2 提取時間對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the content of polysaccharides in R.stenocarpum

2.1.3 提取溫度對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響

固定提取時間30 min，料液比1∶30 g/mL，研究提取溫度對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響，試驗結果見圖3。由圖3可知，當提取溫度為40 ℃時，狹果茶藨子果實多糖提取量達到最大。此后隨著溫度的不斷上升，多糖提取量逐漸下降。推測這可能是由于提取溫度的不斷增大，水的電離常數變大，水當中H+與OH-離子的濃度上升，導致水的極性下降，進而會致使多糖提取量下降[14]，故選取40 ℃作為狹果茶藨子果實多糖的最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the content of polysaccharides in R.stenocarpum

2.2 超聲法提取狹果茶藨子果實多糖提取響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計

表2 響應面試驗結果表Table 2 The table of response surface test result

續表2(Continued Tab.2)

外部融資是采用企業之外的資金來進行并購活動，一般采用債券融資和股權融資兩種形式進行。債券融資可以帶來一定的節稅效果。借款利息可以在上稅之前進行扣除。但是負債會使得企業有還款壓力，負債越多，企業壓力越大，最后可能會使得企業資金周轉困難。股權融資是指企業通過增發等方式出售自己的股份。股票回購沒有固定的期限，企業暫時沒有還款的壓力。但是會影響到之前股東所持有的比例，損失股東的權益。分配利潤之后企業還需要支付股息，股息不可以在繳納企業所得稅之前扣除。

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA results

表4 冪律模型擬合參數Table 4 Fitting parameters for the power law model

經Design-Expert 7.0.0軟件進行響應面試驗，得到圖4。由圖4a可知，響應曲面隨著提取溫度和時間的不斷增大，狹果茶藨子果實多糖提取量先快速上升而后快速降低，由此可知，適當控制提取時間與料液比可提高狹果茶藨子果實多糖的提取量。此外，等高線圖呈橢圓形，說明兩者交互作用明顯，說明兩因素的交互作用對狹果茶藨子果實多糖提取量具有顯著性影響，這與表3方差分析結果一致。由圖4b可知，改變提取溫度和料液比，多糖提取量緩緩升高后緩慢下降，響應曲面較為平緩，且顏色變化不明顯，等高線圖近似圓形，說明兩者交互作用不顯著，與表3結果一致。由圖4c可知，隨著提取時間和料液比的不斷增加，多糖提取量升高后緩慢下降，響應曲面較為平緩，且等高線圖呈橢圓形，故兩者對于狹果茶藨子果實多糖提取量影響顯著。

圖4 各因素交互作用對狹果茶藨子果實多糖提取量的影響Fig.4 Effect of the interaction of various factors on the polysaccharides content of R.stenocarpum

2.2.2 最優條件確定

根據響應面優化得到狹果茶藨子果實多糖提取最佳工藝條件為：提取溫度41.20 ℃、料液比1∶29.86、提取時間29.98 min，為方便試驗操作修正為提取溫度40 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時間30 min，對其進行驗證試驗得到狹果茶藨子果實多糖提取量為115.32±1.01 mg/g，與預測值114.88 mg/g無顯著差異。

2.3 狹果茶藨子果實多糖流變特性研究

2.3.1 多糖濃度對表觀粘度的影響

設置剪切溫度為30 ℃，剪切速率掃描范圍為150～1 000 s-1，多糖濃度對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響見圖5。由圖5a可知，在試驗濃度范圍內，隨著多糖濃度的不斷上升，狹果茶藨子果實多糖的表觀粘度不斷加大。同時隨著剪切速率的不斷增大，多糖溶液的表觀粘度不斷下降，溶液呈現剪切

圖5 狹果茶藨子果實多糖溶液的表觀粘度η(a)和應力σ(b)對剪切速率的依賴性Fig.5 Shear rate dependence of apparent viscosity (a) and stress (b) of RPs

變稀的特性，表現出假塑性流體的特征。當多糖濃度為1.0%(W/V)時，其表觀粘度與0.1%(W/V)羧甲基纖維素鈉表觀粘度接近，兩曲線趨勢也近乎一致，說明多糖溶液在水相中形成了相互交織的網絡結構，改變了水溶液原有的性質，使溶液表現出非牛頓流體行為的特征[20]。此外隨著剪切速率的增加，剪切應力變化曲線(5b)顯示出與粘度曲線相反的趨勢，在試驗濃度范圍內，狹果茶藨子果實多糖的濃度隨著剪切速率的增加而增加，同樣也表明了剪切稀化的特性。

將上述曲線擬合為冪律方程η=kγn-1，其中，η為剪切黏度，k為一致性指數，γ為剪切速率，n為流動行為指數。n為0～1的流體被歸類為假塑性流體；如果n=1，則流體為牛頓流體。如表3所示，系統的n值范圍在0.472～0.543之間，且n值隨著多糖濃度的增大而不斷升高，顯示出更大的剪切稀化的能力，表明狹果茶藨子果實多糖為假塑性流體。

2.3.2 剪切溫度對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響

設置剪切速率為500 s-1，設置剪切溫度范圍為30～80 ℃，研究剪切溫度對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響，試驗結果見圖6。由圖可知，隨著剪切溫度的不斷增加，多糖溶液的表觀粘度不斷降低，表現出假塑性流體的特征。推測這可能是由于高溫使得多糖分子結構發生熱膨脹，分子間距離增大，弱化了多糖分子間的相互纏結，進而致使多糖的表觀粘度呈現下降的趨勢[20]。

圖6 剪切溫度對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響Fig.6 Effect of shear temperature on the apparent viscosity of RPs

2.3.3 pH對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響

設置剪切溫度40 ℃，研究不同剪切速率下pH對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響，試驗結果見圖7。狹果茶藨子果實多糖原有pH為4.8，推測這可能是由于樣品中單糖所含的官能團所致，使溶液呈現弱酸性。同時由圖7可知，隨著pH的不斷降低，狹果茶藨子多糖表觀粘度呈現逐漸上升的趨勢，酸性環境提高了狹果茶藨子果實多糖的表觀粘度，堿性環境弱化了樣品原有的表觀粘度。推測這可能是由于H+與溶液當中的負電荷結合，從而引起了絮凝反應，進而導致溶液的粘度上升。綜合圖5與圖7，發現過酸過堿的環境均能解離狹果茶藨子果實多糖的結構，對溶液的表觀粘度造成一定影響。但由表5可知，過酸過堿的環境均不會改變狹果茶藨子果實多糖的假塑性流體的特征，其溶液具有較好的穩定性，因而據此優良的特性，可將RPs應用于果蔬汁及乳制品飲料的加工過程當中，在提高產品品質穩定性的同時亦可提高產品的營養價值。

表5 冪律模型擬合參數Table 5 Fitting parameters for the power law model

圖7 pH對狹果茶藨子果實多糖表觀粘度的影響Fig.7 Effect of pH on the apparent viscosity of RPs

2.4 狹果茶藨子果實多糖的體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除率

DPPH作為一種穩定且定性良好的固體自由基，廣泛的應用于抗氧化能力的定量測定當中。多糖中含有許多羥基，它們大多能提供氫來還原DPPH自由基，進而達到清除自由基的作用。RPs與抗壞血酸對DPPH自由基的清除率如圖8所示。RPs清除DPPH自由基的IC50值為0.245 mg/mL。此外，在試驗濃度范圍內，RPs對于DPPH自由基的清除率(y)與RPs的質量濃度(x)呈三次依賴關系，表達式為：y=-19.397X3+3.900 0X2-0.267X2+77.013(R2=0.951 0)。當多糖質量濃度為1.00 mg/mL時，樣品對于DPPH自由基的清除率達到最大，為61.32%±0.91%。

圖8 DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH radical scavenging rate

2.4.2 羥自由基清除能力測定

羥自由基是一種反應性極強的化學分子，作為損傷作用最強的自由基，能夠很容易的穿過生物的細胞膜，與多種生物分子發生反應，導致組織損傷或細胞死亡，因此清除羥自由基對于維持生命系統的正常工作起著十分重要的作用。RPs對羥自由基的清除率如圖9所示，在試驗多糖質量濃度范圍內，隨著多糖質量濃度的不斷降低，RPs對于羥自由基的清除能力呈現逐漸下降的趨勢，且RPs對于羥自由基的清除率大于陽性對照抗壞血酸。當多糖質量濃度為1.00 mg/mL時，RPs對于羥自由基的清除能力均達到最大值，為40.27%±0.42%。RPs對羥自由基具有較強的清除能力，推測這可能是由于RPs改善了自由基的供氫能力，從而終止了自由基的鏈式反應。但RPs對于羥自由基的清除作用機理尚不明確，還需進一步的研究來闡明其可能的抗氧化機制。

圖9 羥自由基清除能力測定Fig.9 Determination of hydroxyl radical scavenging ability

2.4.3 總還原能力測定

抗氧化物質具有還原能力，還原能力通常用于評估多糖潛在的抗氧化活性。通過測量700 nm下普魯士藍的形成來測定還原力，700 nm處的吸光度值越高，還原力越強。RPs的還原能力測定結果如圖10所示。由圖可知，RPs還原能力具有一定的劑量依賴性，即隨著多糖質量濃度的不斷降低，樣品的還原能力呈現下降趨勢，同時其還原能力明顯低于陽性對照抗壞血酸。RPs還原能力的測定結果在某種程度上也代表了其潛在的抗氧化活性。

圖10 還原能力測定試驗結果Fig.10 Test result of reducing ability

3 結論

青藏高原野生茶藨子種類繁多，資源豐富，但缺少對其系統的研究與開發利用，此次試驗對青藏高原地區狹果茶藨子果實多糖的提取工藝進行優化，并對其流變特性及體外抗氧化活性予以探討。通過響應面法建立狹果茶藨子果實多糖提取工藝的回歸方程，得到最佳提取條件為：提取溫度40 ℃，料液比1∶30 g/mL，超聲浸提30 min。在此條件下可極大地提高多糖的得率，其提取量最高可達115.32 mg/g；通過流變學研究發現狹果茶藨子果實多糖溶液屬非牛頓流體，具有剪切稀化的特性，溶液的粘度隨著多糖濃度的升高而不斷增大，且過酸過堿的環境均不會對多糖溶液的流變特性造成巨大影響，溶液具有良好的穩定性。說明狹果茶藨子果實多糖具有良好的流變特性，有望從中開發新型的食品天然增稠劑或穩定劑，拓寬狹果茶藨子果實多糖的應用范圍；此外，體外抗氧化試驗表明，狹果茶藨子果實多糖具有潛在的抗氧化活性，對DPPH自由基與羥自由基均具有一定的清除作用。此次試驗可為青藏高原地區狹果茶藨子果實功能性食品的開發提供一定的理論依據，從而促進茶藨子屬植物資源的開發利用。