紅花降糖活性成分譜效關系研究

武鶴婷，賽那瓦爾·芒思爾，高彥華，信學雷 *，寧慧霞

1中國科學院新疆理化技術研究所 中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室省部共建新疆特有要用資源利用重點實驗室，烏魯木齊 830011；2中國科學院大學，北京 100049

紅花為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花，具有活血通經，散瘀止痛。用于經閉、痛經、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅剌痛、跌撲損傷、褡瘍腫痛之功效[1]。紅花主產于新疆，維語名為扎朗子古力，是活血化瘀的傳統藥材之一，其主要活性成分是紅花黃色素(saffloryellow，SY)，羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)、紅花苷、紅花醌及新紅花苷等[2]?，F代藥理學研究表明：紅花提取物可以有效緩解四氧嘧啶所致小鼠糖尿病[3,4]，通過抗氧化清除自由基改善糖尿病癥狀[5]，并在糖尿病腎病[6]、視網膜病變[7]、糖尿病性心肌病[8]等并發癥的治療中發揮了重要的作用，但對其中主要降糖活性成分譜效關系的研究尚未見相關報道。

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的主要成員之一，它是引起胰島素抵抗的重要原因，也是治療糖尿病和肥胖癥的重要靶點，通過抑制PTP1B活性，可顯著改善糖尿病及肥胖癥狀，在糖尿病的發生、發展中起著關鍵的作用[9]。

本研究通過大孔樹脂富集紅花水提取物中的降糖活性成分，評價了降糖活性，建立了紅花降糖活性成分指紋圖譜并進行了聚類分析和主成分分析；通過對照品指認其中主要化學成分后，并采用灰色關聯度和正交偏最小二乘法研究紅花降糖活性成分指紋圖譜與其降糖活性的關系，以關聯度的大小來衡量指紋特征峰對藥效貢獻的大小，最終確定最能反映其藥效的特征峰。最后，利用《中華人民共和國藥典》方法測定了不同產地紅花中HSYA和山柰素的含量，為科學評價紅花降糖作用提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters alliance e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Waters 2487 紫外檢測器；Sartorius BP211D 十萬分之一分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；微孔濾膜( 日本島津公司NY 0.22 μm)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SpectraMax MD5酶標儀(美國Molecular Devices)。

1.2 藥材

紅花采自新疆吉木薩、裕民縣、伊犁霍城縣(見表1)，由中國科學院新疆生態與地理研究所標本館馮纓研究員鑒定為CarthamustinctoriusL.的花。

表1 紅花藥材的來源與種Table 1 Origins and varieties of the flowers of C.tinctorius

1.3 試劑

提取用水為超純水；純化用乙醇(食品級)由天津市百世化工有限公司提供；甲醇(色譜級，Fisher Scientific)；乙腈(色譜級，Fisher Scientific)；甲酸(分析級，默克試劑)；乙醇(食用乙醇)由天津市百世化工有限公司提供；AB-8型大孔樹脂(滄州寶恩化工有限公司)。

PTP1B、醛糖還原酶(aldose reductase，AR)中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室克隆表達、純化；α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,GAA)、二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase-4，DPPIV)、對硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)、礬酸鈉、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、NADPH、DL-甘油醛、阿卡波糖、西他列汀、托瑞司他、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；Compound-2(3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethylbenzo -furan-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-yl-sulfamyl)-phenyl)-amide)由美國Merck公司提供。

1.4 對照品

HSYA對照品(中國科學院新疆理化技術研究所制備，批號：GSB11-3214-2014)；6-羥基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖基-7-O-葡萄糖苷(自制，HPLC測定純度>98%)；其他對照品來自中國食品藥品檢定研究院；對照品山柰素(批號：110861- 200808)；綠原酸(批號：110753-201716 )；異鼠李素(批號：110860-201611)；蘆丁(批號:100080-201811)；金絲桃苷(批號：111521-200303)。

2 實驗方法

2.1 紅花降糖活性成分的制備

制備方法參照文獻[10]略加改進，稱取300 g紅花藥材，加入35倍量的超純水于10 L圓底燒瓶中，70 ℃水浴浸泡30 min，回流40 min，提取2次，合并提取液。將水提液密度濃縮至1.01～1.05 g/mL，然后進行AB-8型大孔吸附樹脂色譜，色譜柱直徑與高度之比為1∶9，洗脫速度為1 mL/min。先用超純水洗脫糖分，待流出液Molisch反應基本呈陰性時，以10%食用級乙醇洗脫，收集流份，濃縮浸膏。

2.2 降糖活性成分指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

Waters alliance e2695高效液相色譜儀；Phenomenex Gemini 110A-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇、乙腈、0.2%甲酸水溶液(V/V，%)；按下表進行梯度洗脫；檢測波長：265 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量20 μL，流動相條件見表2。以理論板數按HSYA峰計算應不低于4 000。

表2 流動相梯度洗脫條件Table 2 Condition of gradient elution of the extract

2.2.2 供試樣和對照品溶液的制備

分別稱取10批紅花藥材，按照“2.1”制備10個批次的活性部位，分別精密稱取活性部位粉末8.0 mg于5 mL容量瓶中，加25% 甲醇水定容，用0.22 μm有機膜過濾，即得。

取HSYA對照品3.0 mg，精密稱定，置容量瓶中，加25% 甲醇水定容制成每1 mL含0.3 mg的溶液，用0.22 μm 有機膜過濾，取濾液，即得。

2.2.3 方法學考察

取同一份紅花樣品的供試品溶液連續進樣6次，按“2.2.1”色譜條件進樣檢測，以HSYA為參比峰，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD為2.60%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

取同一批紅花樣品5份，按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件進樣檢測，以HSYA為對照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD為2.68%，表明該方法具有較好的重復性。

取同一份紅花樣品作為供試品溶液，分別于0、3、9、12、15、24 h檢測指紋圖譜，以HSYA為對照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD為2.12%，表明樣品溶液在24 h內穩定，符合指紋圖譜檢測要求。

2.2.4 活性成分指紋圖譜的建立

將10批紅花活性提取物按“2.2.2”方法制備供試品，按“2.2.1”色譜條件進樣檢測，并記錄相關色譜數據。將10批紅花HPLC圖譜數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A 版)”進行相似度評價，譜圖見圖1。

2.2.5 共有峰的鑒定

按“2.2.1”項的色譜條件，將綠原酸、6-羥基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖基-7-O-葡萄糖苷、異鼠李素、蘆丁、HSYA、金絲桃苷、山柰素的對照品分別進樣，根據樣品保留時間，對指紋圖譜特征峰進行指認，確認其峰歸屬。各對照品保留時間如圖 2所示。

2.2.6 聚類分析

將10批紅花樣品共有峰的相對峰面積作為原始數據導入SPSS 20.0軟件，采用平方歐式距離為樣品間距離計算方法，對數據進行標準化轉換，進行聚類分析。

2.2.7 主成分分析

為了進一步探討不同產地的紅花成分間的差異性，在相似度和聚類分析的基礎上，對指紋圖譜所得到的8個共有峰的峰面積進行標準化處理，以標準化后的共有峰峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件進行主成分分析。

2.3 降糖活性的測定

所有活性測定樣品用DMSO溶解，反應體系中DMSO終濃度<2%(V/V)。

2.3.1 PTP1B活性的測定

用對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)作為底物，參照文獻[11]方法進行測定，獲得不同濃度的抑制率，并運用IBM SPSS 20.0統計分析軟件計算最大半數抑制濃度(IC50)。

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

以PNPG為底物，參照文獻[11]方法進行測定，以不含酶溶液體系為空白，以阿卡波糖為陽性對照，獲得不同濃度的抑制率，并運用IBM SPSS 20.0統計分析軟件計算IC50。

2.3.3 二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制活性的測定

參照文獻[12]方法進行測定，以不含酶溶液體系為空白，以西他列汀為陽性對照。獲得不同濃度的抑制率，并運用IBM SPSS 20.0統計分析軟件計算IC50。

2.3.4 醛糖還原酶抑制活性的測定

參照文獻[12]方法進行測定，按不同劑量加入樣品，340 nm處測定吸收值，每個實驗重復 3 次，獲得不同濃度的抑制率，并運用IBM SPSS 20.0統計分析軟件計算IC50。

2.4 灰色關聯度分析

2.4.1 原始數據處理

將各差異樣品的藥效學指標組成參考數列，將各差異樣品的指紋圖譜中的各共有峰峰面積組成比較數列。對所述參考數列和比較數列進行無量綱化處理;優選采用均值化方法進行處理。

2.4.2 求絕對差序列

以藥理效應值即樣品對PTP1B酶抑制作用的 IC50值列為參考數列(Yo(m))，指紋圖譜共有峰峰面積列為比較數列(Yi(m))，按公式計算絕對差數列(△oi(m))，其中△oi(m)=丨Yo(m)-Yi(m)丨。所得的無量綱化的參考數列和比較數列，以用于計算各共有峰與藥效之間的關聯度。

2.4.3 求關聯系數

關聯系數反映2個被比較序列的靠近程度。比較序列(Yi(m))與參考序列(Yo(m))的關聯系數按公式計算：Koi=(△min+ρ△max)/(△oi(m)+ρ△max)(分辯系數取ρ=0.2)。

2.4.4 求關聯度

各類關聯系數以平均值法求得，對步驟“2.4.3”所得關聯度進行排序，以評價共有峰的藥效活性，關聯度大于0.6，視為活性組分。據此可尋找指紋特征峰對應的化學成分與藥效間的聯系。

2.5 正交偏最小二乘法驗證

灰色關聯度分析方法雖然能夠很好地識別出指紋圖譜中與抑制活性有較高相關性的峰，但其不能識別出抑制活性與相關峰的正、負關系。本研究使用SIMCA-P14.1軟件，采用正交偏最小二乘法進一步驗證了各產地活性成分PTPT1B的IC50與指紋圖譜中8個峰的相關性。

2.6 不同產地紅花中主要成分的測定

按照《中華人民共和國藥典》2015版中記載的紅花HSYA、山柰素含量測定方法，測定不同產地10批次紅花原料中HSYA、山柰素含量。

2.6.1 HSYA的測定時對照品及供試品溶液的制備

分別取10批紅花粉末(過三號篩)0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25% 甲醇水溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，再稱重，用25%甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm有機膜過濾，取濾液，即得。

精密稱定HSYA對照品5.07 mg置10 mL容量瓶中，用25%的甲醇水溶液定容，再稀釋為0.15 mg/mL的溶液，用0.22 μm 有機膜過濾，取濾液，即得。

2.6.2 山柰素的含量測定時對照品及供試品溶液的制備

精密稱定山柰素對照品2.19 mg置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，再稀釋為0.087 6 mg/mL的溶液，用0.22 μm有機膜過濾，取續濾液，即得。

分別精密稱取10批紅花粉末0.5 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液15 mL，置平底燒杯中，加鹽酸溶液5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉移至25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.7 統計分析

文中所涉及的所有統計分析使用SPSS20.0或SIMCA-P14.1完成。

3 結果與分析

3.1 紅花降糖活性部位的制備

按照“2.1”中所述方法得到黃色粉末13 g，室溫干燥并保存作為紅花活性部位(得率約為4%)，備用。

3.2 降糖活性成分指紋圖譜的建立

3.2.1 指紋圖譜的建立

將10批紅花活性提取物按“2.2.2”方法制備供試品，按“2.2.1”色譜條件進樣檢測，并記錄相關色譜數據。將10批紅花HPLC圖譜數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)”進行相似度評價，譜圖見圖1。設定參照圖譜，將各色譜圖自動匹配，生成對照譜圖，進行相似度計算，結果見表3。10批新疆不同產地的紅花相似度在0.95以上，均已達到相似度的基本要求，說明樣品之間具有良好的相似度。

圖1 10批紅花藥材有效部位HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of the water extract of the flowers of C.tinctorius

表3 10批紅花藥材有效部位的共有峰峰面積與相似度RTable 3 Common peaks of the water extract in HPLC spectrum from 10 samples and gray relation grades

3.2.2 主要化學成分的指認

通過對照品及保留時間對對照指紋圖譜進行指認，確定共有峰2～8號分別為綠原酸、6-羥基山柰酚-3，6-雙-O-葡萄糖基-7-O-葡萄糖苷、異鼠李素、蘆丁、HSYA、金絲桃苷和山柰素(見圖2)。

圖2 紅花降糖提取物中主要成分確認Fig.2 Recognition of main principles in antidiabetic extract from the flowers of C.tinctorius 注：A：綠原酸對照品；B：6-羥基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖基-7-O-葡萄糖苷；C：異鼠李素對照品；D：蘆丁對照品；E：HSYA對照品；F：金絲桃苷對照品；G:山柰素對照品；H：紅花降糖提取物。Note:A:Chlorogenic acid;B:6-Hydroxykaempferol-3,6-di-O-glucose-7-O-glucoside;C:Isorhamnetin;D:Rutin,E:HSYA;F:Hyperoside;G:Kaempferide;H:Antidiabetic extract of the flowers of C.tinctorius.

3.2.3 聚類分析

將10批紅花樣品共有峰的相對峰面積作為原始數據導入SPSS 20.0軟件，采用平方歐式距離為樣品間距離計算方法，對數據進行標準化轉換，進行聚類分析，從樹狀譜系圖(圖3)結果可以看到，當類間距離>5時，可將樣品分為2類，9為第I類，2、10、1、5、6、7、3、4、8為第II類，即伊犁產吉紅1號與其他產地紅花之間存在差異。

圖3 不同產地紅花聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of the flowers of C.tinctorius from different area

3.2.4 主成分分析

采用SPSS 20.0軟件進行主成分分析，結果見表4，選取前3個特征值>1成分為主成分，對紅花指紋圖譜進行描述，其累計方差貢獻率為82.105%，能夠較好地反映其化學成分特征。并根據公式 F= (0.478 42F1+0.197 05F2 +0.145 57F3)/82.105，計算綜合得分結果見表5、6。

表4 主成分特征值及累計方差貢獻率Table 4 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate

表5 主成分矩陣Table 5 Principal component matrix

3.3 降糖活性成分分析

通過PTP1B、GAA、DPP IV和HAR四個體外降糖活性測定，發現紅花活性部位對PTP1B有較好的抑制作用，其IC50為8.43 μg/mL，紅花水提取物對GAA抑制作用優于陽性藥阿卡波糖；而對DPPIV和HAR抑制作用較弱。結果表明紅花活性部位能抑制PTP1B，提高胰島素敏感性；抑制GAA能延緩葡萄糖的吸收，結果見表7。PTP1B抑制活性可以進一步用于譜效關系分析，不同產地紅花活性成分的PTPT1B抑制率見表8。

表6 不同產地紅花主成分得分和綜合評分Table 6 Principal component score and comprehensive score of the flowers of C.tinctorius from different area

表7 紅花水提取物針對胰島素抵抗的四個酶分子靶點的抑制作用(mean±SD)Table 7 The inhibition of insulin resistance in four molecular target enzymes of water extracts of the flowers of C.tinctorius (mean±SD)

表8 10批紅花藥材的有效部位的PTP1B酶抑制活性(mean±SD)Table 8 Effect of the water extracts of 10 samples on PTP1B inhibition activity(mean±SD)

3.4 灰色關聯度分析

以藥理效應值即樣品對PTP1B酶抑制作用的IC50(表5)值列為參考數列(Yo(m))，指紋圖譜共有峰峰面積(表3)列為比較數列(Yi(m))，按照“2.4”的方法進行灰色關聯度計算，所得結果見表9。

表9 紅花降糖有效部位的譜效關系Table 9 Antidiabetic spectrum-effect relationship of water extraction from the flowers of C.tinctorius

灰色關聯度分析表明：其抑制活性與指紋圖譜中獲得的7個共有峰有關聯，說明這7個峰在降糖作用中具有協同作用，其中關聯度和含量都比較高的是HSYA(6號峰)和6-羥基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖基-7-O-葡萄糖苷(3號峰)。7個色譜峰關聯度從大到小，順序為P5>P6>P3>P1>P7>P4>P8。

3.5 正交偏最小二乘法驗證

灰色關聯度分析方法雖然能夠很好地識別出指紋圖譜中與抑制活性有較高相關性的峰，但其不能識別出抑制活性與相關峰的正、負關系。本研究使用SIMCA-P14.1軟件，采用正交偏最小二乘法進一步驗證了各產地活性成分PTPT1B的IC50與指紋圖譜中8個峰的相關性，得到IC50與8個峰的標準化回歸系數圖，如圖4。由圖4可以看出，峰7與IC50呈正相關，峰1、峰3、峰4、峰5、峰6和峰8等6個峰與IC50呈負相關。峰2對抑制活性幾乎無影響。通過回歸系數的絕對值可知，7個峰對于IC50的影響順序為P6>P3>P1>P8>P4>P5>P7。擬合結果與灰色關聯度法結果相近。

圖6 標準化回歸系數圖Fig.6 Normalized regression coefficient diagram

3.6 紅花藥材HSYA和山柰素含量測定結果

對10批不同來源的紅花樣品中HSYA和山柰素的含量測定結果見表8。從新疆不同產地紅花的含量測定結果可以看出，HSYA的含量范圍在1.670 1%～1.937 5%之間，所有的紅花樣品中HSYA的含量均遠高于《中華人民共和國藥典》標準(1%)。從伊犁的測定結果可以看出，同一產地樣品中，旱地的HSYA含量高于漫灌水田；伊犁地區中，高海拔種植的樣品HSYA含量較高。

由所得數據也可以看出新疆不同產地紅花中山柰素的含量比較穩定，山柰素的含量范圍在0.094%～0.124 2%之間，遠高于《中華人民共和國藥典》標準(0.050%)，新疆是紅花的適宜種植區域。

4 討論與結論

紅花在世界范圍內廣泛種植，是一種藥食兩用的作物。中藥指紋圖譜能夠較好反映中藥的“多組份、多靶點、多途徑綜合調節作用”的特點，然而，目前大多數中藥的活性成分及其物質基礎是不明確的，建立在中藥化學指標成分之上的中藥指紋圖譜并不能有效地表現其與藥效的相關性，因此只有將標示有中藥活性成分群的特征峰的指紋圖譜與其藥效結果對應起來，即將中藥指紋圖譜中化學成分含量變化與其藥效變化聯系起來，建立起中藥譜效關系，才能有效地反映其內在質量。在本研究中，首次聯合評價了紅花降糖有效部位指紋圖譜中所標示的化學成分與活性的關系。

表10 10批紅花藥材中HSYA和山柰素的含量測定Table 10 Contents of the hydroxysafflor yellow A and kaempferide in the 10 batches of the flowers of C.tinctorius samples

紅花降糖有效部位的制備方法，是通過對紅花加熱回流提取、大孔樹脂分離純化獲得，通過建立紅花降糖活性部位指紋圖譜，找到了不同產地藥材的8個共有峰，結合紅花中化學成分的報道，通過對照品比對指認出其中7個峰。聚類分析表明除吉紅1號外，其他品種之間沒有差異。

通過對活性部位進行降糖活性篩選，發現不同產地的藥材的活性成分均能有效抑制PTP1B和α-葡萄糖苷酶，且對 PTP1B 的抑制活性較突出，故選取其作為譜效關系的研究對象，利用灰色關聯度和正交偏最小二乘法進行譜效關系分析，為紅花降糖活性成分的質量控制提供了更為全面和準確的信息?；疑P聯度分析法被廣泛應用于中藥譜效研究，雖然它對樣本要求不高，但容易受到分辨系數的影響，且關聯度均為正值，不好判斷其具體的作用[13]，因此我們選用正交偏最小二乘法與之聯用，并得到了類似的結果。兩種分析方法均表明其抑制活性與指紋圖譜中獲得的7個共有峰有關聯，說明這7個峰在降糖作用中具有協同作用，其中HSYA(6號峰)和6-羥基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖基-7-O-葡萄糖苷(3號峰)是其中主要的活性成分，這一工作也為紅花在糖尿病藥物研發領域的應用提供了支撐。

紅花中HSYA和山柰素含量測定結果也表明，新疆紅花中這兩種主要成分的含量遠高于《中華人民共和國藥典》標準，證明紅花品質優良，新疆是紅花適宜種植的區域。