五子衍宗丸多糖對過氧化氫所致心肌細胞損傷的影響*

陳桂林，徐姍，吳紫娟，吳祎

(江蘇省常州市第二人民醫院藥學部，常州 213000)

冠狀動脈球囊擴張、冠狀動脈內溶栓以及冠狀動脈旁路移植術在缺血性心臟病治療中應用廣泛，其能夠恢復心肌血流，挽救患者生命，但手術造成的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷已成為日益突出的問題[1-2]。研究表明，心肌損傷區過量自由基是引發心肌損傷的關鍵，自由基清除劑能緩解組織和細胞損傷[3-5]。五子衍宗丸最早記載于唐代，由五味藥材(枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子)組成，有研究認為五子衍宗丸多糖具有清除自由基作用[6]。筆者在本研究中從五子衍宗丸提取多糖(即五子衍宗丸多糖)，并用于治療心肌缺血性疾病模型，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1試藥與儀器 五味子(批號：20180108)、菟絲子(批號：20180115)、枸杞子(批號：20180118)、覆盆子(批號：20180122)、車前子(批號：20180130)各50 g，均購自廣州致信藥業有限公司，經本院藥學部吳祎副主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。

白細胞介素6(IL-6)標準品購自美國Sigma公司(批號：2018025556)，IL-12標準品購自美國Sigma公司(批號：2018025891)；正常小鼠心肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司(批號：CP-M073)；噻唑藍(MTT)比色法試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(批號：2018-1123)；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號分別為20180315，20180419，20180423，20180321，20180410，20180417)，IL-6酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(批號：2018-5297)和IL-12 ELISA試劑盒(批號：2018-09028)購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗人B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)單克隆抗體(批號：2018036500)、兔抗鼠Bac多克隆抗體(批號：2018029985)、兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3)單克隆抗體(批號：2018061135)、二抗辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG(批號：2018090046)購自美國Sigma公司。ELISA酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司(儀器型號：HBS-1096C)；免疫蛋白印跡法(Western blotting)電泳儀購自美國Bio-rad公司。

1.2五子衍宗丸多糖的提取與鑒定 將五味子、菟絲子、枸杞子、覆盆子以及車前子等5 種中藥材粉碎，根據《中華人民共和國藥典》2015年版記錄混勻，石油醚回流2 次。藥渣以50%乙醇回流提取，所得樣品以水溶解，再以正丁醇萃取，將藥渣水提取濃縮液混合均勻，乙醇沉淀，干燥后得五子衍宗丸多糖[6]。

五子衍宗丸多糖的鑒定：準確吸取樣品測定液2.0 mL，置25 mL比色管，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，旋轉混勻器混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL于旋轉混勻器上，小心混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，分光光度計在波長485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度值。從標準曲線上查出葡聚糖含量，計算樣品中多糖含量[6]。

1.3細胞的分組與處理 取正常小鼠心肌細胞，培養，隨機分為5組：陰性對照組，正常小鼠心肌細胞分離純化后培養[7-8]；誘導組，正常小鼠心肌細胞培養液加入100 μmol·L-1過氧化氫(H2O2)，反應2 h；大劑量組，以1×10-4mol·L-1五子衍宗丸多糖培養正常小鼠心肌細胞24 h，加100 μmol·L-1H2O2反應2 h；中劑量組，以5×10-5mol·L-1五子衍宗丸多糖培養正常小鼠心肌細胞24 h，加入100 μmol·L-1H2O2反應2 h；小劑量組，以1×10-5mol·L-1五子衍宗丸多糖培養正常小鼠心肌細胞24 h，加入100 μmol·L-1H2O2反應2 h。

1.4心肌細胞活力檢測 采用MTT比色法檢測分離純化的小鼠心肌細胞活力。將小鼠心肌細胞分組處理，每孔加5 mg·mL-1MTT 20 μL，反應4 h。除去上清液，加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，酶標儀檢測波長570 nm處吸光度值(A值)。

1.5總抗氧化能力及氧化平衡體系酶測定 應用酶偶聯法檢測心肌肌酸激酶(creatine kinase，CK)；比色法檢測心肌細胞總抗氧化能力(total antioxidant capacity of cardiomyocytes，T-AOC)，2，4 -二硝基苯肼顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力，二硫代二硝基苯甲酸法檢測谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，鉬酸銨法檢測過氧化氫酶(catalase，CAT)活力。

1.6ELISA法檢測小鼠IL-6與IL-12水平 酶標儀測量在波長450 nm處A值，以標準品A值為橫坐標，以0，0.5，1，2，5，10 ng·μL-1IL-6的A值為縱坐標；以IL-12標準品A值為橫坐標，以0，5，10，20，50，100 pg·μL-1IL-12A值為縱坐標，根據Curve Expert1.3版軟件繪制標準曲線。根據樣品A值，以Excel WPS計算相應濃度。

1.7Western blotting檢測相關蛋白表達 將小鼠心肌組織研磨成粉末，裂解30 min，4 ℃離心，提取上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白活性測定試劑盒檢測蛋白定量。取蛋白30 μg進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，電泳分離的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，室溫下5%脫脂牛奶反應1 h，充分洗滌，分別添加一抗小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1：1 000 )、兔抗鼠Bax多克隆抗體(1：1 000 )及兔抗人caspase-3單克隆抗體(1：1 000)，4 ℃過夜，充分洗滌，添加HRP標記的山羊抗兔IgG(1：10 000)或HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1：10 000)，室溫反應30 min，充分洗滌，電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)化學發光液反應1 min，全自動數碼凝膠圖像分析系統攝影。

2 結果

2.1心肌細胞活力 結果見表1。與陰性對照組比較，誘導組心肌細胞A值降低(P<0.05)，提示其細胞活力下降；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組A值升高(P<0.05)，提示五子衍宗丸多糖可有效提升被H2O2損傷的心肌細胞活力。

2.2心肌細胞上清液LDH與CK釋放量 結果見表2。與陰性對照組比較，誘導組心肌細胞上清液LDH和CK釋放量升高(P<0.05)；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組細胞上清液LDH與CK釋放量均降低(P<0.05)。

2.3心肌細胞SOD與MDA含量測定結果 結果見表3。與陰性對照組比較，誘導組心肌細胞SOD活力降低(P<0.05)；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組SOD活力增加(P<0.05)；與陰性對照組比較，誘導組細胞MDA含量升高(P<0.05)；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖高劑量組MDA降低(P<0.05)。

2.4心肌細胞GSH-Px與CAT含量 結果見表4。與陰性對照組比較，誘導組GSH-Px活性降低；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖中、大劑量組細胞GSH-Px活性更高(P<0.05)；與陰性對照組比較，誘導組CAT活性降低(P<0.05)；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組CAT活性升高，其中大劑量組CAT活性明顯高于誘導組(P<0.05)。

表1 5組心肌細胞活力測定結果

表2 5組心肌細胞上清液LDH與CK釋放量測定結果

2.5心肌細胞中IL-6與IL-12 結果見表5。與陰性對照組比較，誘導組細胞培養液IL-6與IL-12含量升高(P<0.05)；與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組細胞培養液IL-6與IL-12含量降低(P<0.05)。

2.6Bcl-2，Bax及caspase-3蛋白表達 結果見表6及圖2。Western bloting結果表明，誘導組細胞培養液Bcl-2 及caspase-3蛋白表達高于陰性對照組，Bax蛋白表達量低于陰性對照組(均P<0.05)。與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組Bcl-2和caspase-3蛋白表達量減少，Bcl-2 及caspase-3蛋白表達下調，Bax蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 5組心肌細胞SOD及 MDA含量測定結果

表4 5組心肌細胞GSH-Px與CAT含量測定結果

3 討論

心肌細胞損傷時，心肌細胞中CK、LDH以及AST等酶被釋放入血，因此其均屬于心肌損傷關鍵標志物[9-10]。MDA導致機體出現脂質過氧化物[11-12]，一般可用于檢測細胞損傷程度[13-14]。MTT檢測發現，H2O2可抑制小鼠心肌細胞活性，五子衍宗丸多糖能提升過氧化損傷心肌細胞活力。本研究結果顯示，正常心肌細胞會被H2O2損傷，心肌細胞外LDH和CK釋放量升高，細胞內MDA含量升高，表明H2O2引發細胞過氧化損害。

表5 5組心肌細胞上清液IL-6與IL-12測定結果

表6 5組心肌細胞Bcl-2，Bax及Caspase-3蛋白表達量測定結果

與誘導組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組細胞外液LDH和CK量降低，細胞內MDA含量降低，表明五子衍宗丸多糖可緩解細胞損傷。SOD可以清除自由基，在抗氧化機制中十分關鍵[15-16]。GSH-Px可維護細胞膜功能[17-18]。本研究顯示，五子衍宗丸多糖能提升過氧化損傷心肌細胞SOD、GSH-Px及CAT活性。表明五子衍宗丸多糖可有效提升心肌細胞SOD、GSH-Px及CAT活性，抑制脂質過氧化反應，對受損細胞進行修復。即五子衍宗丸具有清除氧自由基、抗氧化損傷、維持機體抗氧化防御系統平衡和抑制多元醇通路異?；钴S作用，從而減輕組織細胞損傷，其機制可能與其抗氧化應激、抑制炎癥細胞因子TNF-α表達有關。本研究與殷金龍等[22]研究相互印證，即五子衍宗丸抗炎活性可能通過抑制核因子-κB 信號通路介導的炎癥反應以及抗氧化應激實現。

圖2 5組Bcl-2，Bax及caspase-3蛋白表達

綜上所述，五子衍宗丸多糖可有效緩解心肌細胞過氧化損傷，抑制機體脂質過氧化反應，緩解炎癥因子對心肌細胞的損傷，其作用機制可能與下調Bcl-2 及Caspase蛋白表達、上調Bax蛋白表達有關。因此推測五子衍宗丸多糖可用于治療心血管疾病。