大蒜素抑制胃癌細胞上皮-間質轉化作用及其機制*

徐丹，李瑞陽，李晶，王儒涵，蘭婷，鞏平

(石河子大學醫學院第一附屬醫院腫瘤內科，石河子 832000)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常見的惡性腫瘤之一[1]，由于胃癌高侵襲性及高轉移性，大多數患者確診時已屬晚期。研究發現[2]，上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)能使細胞獲得侵襲、轉移特征。大蒜素(allicin)是從大蒜中提取的揮發性油狀物，其主要化學成分二烯丙基三硫化物(diallyl trisul fidc，DATS)是大蒜素發揮抗癌活性的主要物質[3]。有報道顯示，大蒜素對宮頸癌、結腸癌等多種腫瘤均有明顯抑制作用[4]，是理想的抗腫瘤藥物。本研究以白細胞介素6(IL-6)體外誘導胃癌細胞系，構建胃癌細胞EMT模型，觀察大蒜素對其E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及核因子κB P65 (NF-κB P65)表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞株HGC-27(中國科學院細胞庫，目錄號：TCHu 22) ；大蒜素注射液(Solarbio，規格：每瓶20 mg，批號：SA8720)；重組人IL-6(美國Peprotech公司，批號：031316-1) ；青鏈霉素混合液( Solarbio，批號：20170720)，RPMI1640培養基[塞默飛世爾(蘇州)生物化學制品有限公司，批號：8117196]；二甲基亞砜(Solarbio，批號：520C0318) ；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，美國Gibco公司，批號：10091-148) ；Transwell試劑盒(美國康寧公司，批號：23317042)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所，批號：KS607)；Matrigel matrix(美國康寧公司，批號：7156009)；無菌超凈工作臺(上海力新公司)；二氧化碳(CO2)培養箱(美國ThermoScientific公司)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；7500 FastReal-TimePCR system(美國AB公司)。

1.2方法

1.2.1細胞的培養 人胃癌細胞株HGC-27培養于含10%FBS、青鏈霉素混合液(×100)RPMI-1640培養基，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養箱培養。細胞70%～80% 融合時以胰蛋白酶消化傳代，每2或3 d傳代1次。共分為4組：空白對照組，培養胃癌細胞HGC-27，不作任何處理；IL-6組，常規培養胃癌細胞HGC-27，加入50 ng·mL-1IL-6培養72 h；大蒜素組，常規培養胃癌細胞HGC-27，加入3 μg·L-1大蒜素培養48 h；大蒜素聯合IL-6組，常規培養胃癌細胞HGC-27，加入50 ng·mL-1IL-6培養72 h，再加入3 μg·L-1大蒜素繼續培養48 h。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應(realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗 分組同“1.2.1”項，按照RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒說明，提取各組細胞 RNA并反轉錄為cDNA。按反應條件進行相關反應，每組設3個復孔。以肌動蛋白β(actin beta，β-Actin)為內參，將空白對照組mRNA表達量定為100%，以 2-△△Ct法計算E-cadherin、vimentin及NF-κB P65mRNA相對表達量，PCR反應條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環。各基因引物由上海生工生物公司設計合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3CCK-8實驗 取對數生長期胃癌細胞株HGC-27，胰酶消化，制成單細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板(每孔2.0×103個)，細胞貼壁后棄去原培養液，分別以配制好的IL-6、大蒜素、大蒜素聯合IL-6培養液處理，空白對照組加入等體積RPMI 1640混合培養液，置于37 ℃恒溫細胞培養箱繼續培養，分別于24，48和72 h加入CCK-8 試劑(每100 μL培養液含CCK-8試劑10 μL)，繼續培養2 h，酶聯免疫檢測儀檢測波長450 nm處各孔吸光度(A值)。

1.2.5Transwell體外侵襲實驗 將1：8稀釋Matrigel(RMPI 1640稀釋)加入Matrigel侵襲小室上室，37 ℃放置2 h，水化基底膜，制備細胞懸液：按照“1.2.1”項分組，隨后用胰蛋白酶消化各組處理好的細胞，終止消化后離心棄去培養液，無血清RPMI 1640培養基沖懸，借助細胞計數板調整細胞密度，接種6×104含無血清培養液于小室上室，向小室下室24孔板加入含20%FBS的RMPI 1640培養液，37 ℃培養48 h。取出侵襲小室，吸凈上室培養基，甲醛固定20 min，結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液清洗3次，棉簽輕輕擦凈上室，倒置顯微鏡下計數膜背面細胞數，隨機計數6個視野，取平均值，每組重復3次。

2 結果

2.1E-cadherin、vimentin及NF-κB P65表達情況 RT-qPCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，IL-6組E-cadherin表達下調，vimentin及NF-κB P65表達上調(均P<0.05)；與空白對照組比較，大蒜素組E-cadherin表達上調，Vimentin及NF-κB P65表達下調(均P<0.05)；與IL-6組比較，大蒜素聯合IL-6組E-cadherin表達上調，Vimentin及NF-κB表達下調，均差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2CCK-8實驗結果 見表2。與空白對照組比較，大蒜素組不同時間細胞增殖能力明顯減弱，差異有統計學意義(均P<0.05)；與空白對照組比較，IL-6組不同時間細胞增殖能力更高(均P<0.05)；與IL-6組比較，大蒜素聯合IL-6組不同時間細胞增殖能力減弱(均P<0.05)。見圖2。

2.3細胞劃痕實驗 空白對照組、IL-6組、大蒜素組、大蒜素聯合IL-6組12 h劃痕愈合比分別為(27.78±6.72)%，(23.50±3.49)%，(5.70±3.85)%，(13.29±5.03)%；24 h劃痕愈合比分別是(46.60±2.10)%，(51.06±2.11)%，(29.30±3.07)%，(36.43±0.96)%。與空白對照組12，24 h比較，大蒜素組劃痕愈合百分比減小，差異有統計學意義(P<0.05)；與IL-6組12，24 h比較，大蒜素聯合IL-6組劃痕愈合百分比縮小(P<0.05)，尤其是24 h，IL-6組劃痕處幾乎被遷移細胞遮蓋，而大蒜素聯合IL-6組細胞遷移能力明顯減弱(圖3)。

①與空白對照組比較，t=-6.933～7.473，P<0.05；②與IL-6組比較，t=-4.052～3.575，P<0.05。

表2 4組細胞不同時間增殖能力比較(A450)

2.4Transwell體外侵襲實驗結果 空白對照組、IL-6組、大蒜素組、大蒜素聯合IL-6組每視野穿過Transwell侵襲小室的細胞數均呈正態分布，分別為139.00±9.35，161.40±18.93，91.00±12.21，109.60±2.51。與空白對照組比較，大蒜素組侵襲數目明顯減少，IL-6組侵襲數目增多，差異有統計學意義(P<0.05)；與IL-6組比較，大蒜素聯合IL-6組侵襲數目表現出減少趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

EMT是許多腫瘤侵襲和轉移的重要過程。在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發生發展的過程中均發現EMT作用[5]。在EMT發生中，常發現E-cadherin表達下調或E-cadherin-環連蛋白復合物功能失調[6]。存在于間充質細胞中的中間絲蛋白vimentin在調節細胞骨架蛋白、細胞粘附分子等方面也起到非常重要的作用。多條通路都能誘導EMT，很多研究認為，多種轉錄因子及其他調控因子、microRNAs、各種細胞微環境等可通過Wnt/β-catenin、EGFR/Ras和TGF-β/Smad等信號轉導通路激活EMT[7]。然而，針對NF-κB信號通路的研究指出，在各類血液腫瘤或實體腫瘤中，例如黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]和結腸癌[10]等，NF-κB的活性組成性高。而且NF-κB活性組成的抑制是通過抑制腫瘤細胞的組織侵襲和轉移能力，降低轉化細胞的惡性增殖能力等方式阻斷腫瘤細胞的致癌性[11]。NF-κB是一種重要的轉錄調節因子，在刺激因素作用下，胞質中的抑制蛋白IκB發生磷酸化降解，解除了對NF-κB的抑制，釋放其進入核內參與調節多種基因的轉錄表達，使其在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用[12]。

圖2 4組細胞不同時間增殖能力比較

①與空白對照組比較，t=4.941～8.054，P<0.05；②與IL-6組比較，t=2.890～10.938，P<0.05。

①與空白對照組比較，t=2.372～6.979，P<0.05；②與IL-6組比較，t=-6.066，P<0.05。

大蒜素是多種烯丙基有機硫化物的復合體，天然存在于百合科植物大蒜的鱗莖中，其有效攝入可抑制多種腫瘤，如肺癌、肝癌及胰腺癌等的發生[13-14]。本研究探討NF-κB信號通路是否在大蒜素對胃癌EMT作用機制中產生影響。RT-qPCR結果顯示，與空白對照組比較，IL-6組E-cadherin表達下調，vimentin表達上調，說明IL-6誘導胃癌細胞發生了EMT；此外，與IL-6組比較，大蒜素聯合IL-6組E-cadherin表達上調，vimentin表達下調，表明大蒜素對IL-6誘導胃癌細胞的EMT具有抑制作用，即大蒜素對經IL-6誘導胃癌細胞發生了EMT；同時大蒜素聯合IL-6組NF-κB表達明顯下降，故推測大蒜素可能通過調節NF-κB信號通路發揮對胃癌HGC-27細胞侵襲轉移的抑制作用。通過增殖、遷移、侵襲等相關功能實驗進一步證實，發生EMT的胃癌細胞系侵襲和轉移能力均提高，而大蒜素可逆轉這一過程。

此外，EMT也參與細胞外基質、基底膜降解和破壞的溶解酶，從而破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，便于細胞從原發腫瘤分離脫落，發生侵襲轉移。因此，研究EMT分子調控機制可為研究預防腫瘤轉移提供有利平臺。有研究證實[14]，經大蒜素處理的胰腺癌細胞間質細胞表型向上皮細胞表型轉化、侵襲、遷移能力明顯減弱，與本研究的結果一致。CHEN等[15]研究發現，與對照組比較，大蒜素不僅可以顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，還可以下調腫瘤組織vimentin的水平。

綜上所述，大蒜素能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這種機制可能通過調節NF-κB信號通路，抑制IL-6誘導的胃癌細胞EMT效應實現，從而可能在有IL-6過表達的晚期腫瘤組織侵襲轉移過程中發揮重要作用。但大蒜素對胃癌細胞具體的作用機制及NF-κB信號通路對EMT的調控作用有待進一步研究。