免疫佐劑對禽流感疫苗抗體的影響評價

陳生雷，王一平，谷崇高，陳欣婷，李鳳艷，舒秀偉

（遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000）

重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株、H7N9H7-Re3株）可預防由H5亞型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d 分支和H7亞型禽流感病毒引起的禽流感[1-3]，多應用于雛雞和成雞的免疫，具有免疫效果好、安全性高的特點，廣泛應用于雞養殖生產[4-6]。免疫佐劑是一種能夠強化疫苗抗體生成的物質[7]。免疫佐劑與疫苗同時使用可以提高疫苗的免疫應答率[8]。在實際疫苗免疫中，因為動物個體差異造成動物免疫效果不理想，重復接種工作煩瑣，成本較高[9]。為一次性獲得免疫應答效果，研究人員不斷研究增加疫苗免疫應答率的方法。其中使用免疫佐劑是目前最有效的實現疫苗免疫增強的方式[10-12]。本試驗采用不同抗原含量配比并添加免疫佐劑，通過效力檢驗了解免疫佐劑對禽流感抗體產生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

28日齡SPF雞由遼寧益康生物股份有限公司提供。

1.2 試驗材料

禽流感H5N1Re-11株滅活抗原、H5N1Re-12株滅活抗原、H7N9H7-Re3株滅活抗原，均由遼寧益康生物股份有限公司制備檢驗。白油（大連百潤祥經貿有限公司，批號688826）、吐溫（CRODA 公司，批號46389）、司本（CRODA公司，批號45278）。免疫佐劑（Ⅱ）由遼寧益康生物股份有限公司制備，檢驗。

1.3 試劑與儀器

禽流感病毒H5亞型陽性血清（Re-11株）、禽流感病毒H5亞型陽性血清（Re-12株）、禽流感病毒H7亞型陽性血清（H7-Re3 株）、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原（Re-12 株）和禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原（H7-Re3 株），均由遼寧益康生物股份有限公司提供。

T25高速剪切機（IKA公司）、BSC-1304IIA2生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）、3k15高速冷凍離心機（Sigma公司）。

1.4 試驗設計

取95 份注射白油加熱，加入5 份司本-80，混勻，高壓滅菌。94 份含定量免疫佐劑（Ⅱ）的抗原加入6 份滅菌吐溫-80，充分振蕩使吐溫-80完全溶解。乳化罐中加入3份油相與2份水相，充分攪拌乳化，2～8 ℃保存。

將禽流感的3 種抗原按不同抗原含量添加免疫佐劑（Ⅱ）配苗乳化，分別為：A組抗原含量為30%，不添加免疫佐劑，設為對照組；B 組抗原含量為30%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；C 組抗原含量為25%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；D 組抗原含量為20%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；E 組抗原含量為15%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；F 組為不免疫對照組。按乳化試驗方法進行成品疫苗的配制，各分組分別制備300 mL成品疫苗。成品疫苗配制方案見表1。對28 日齡SPF 雞進行疫苗免疫，劑量為0.3 mL/只。

表1 成品疫苗配制方案Tab.1 Finished vaccine formulation program

1.5 測定指標及方法

分別于免疫后7、14、21 d 對雞靜脈采血，37 ℃孵育1 h，6 000 r/min 離心3 min，分離血清，-20 ℃保存。采用HI 方法測定禽流感H5亞型Re-11 株和Re-12 株、禽流感H7亞型H7Re-3株HI抗體效價，標定抗原為4單位抗原。

2 結果與分析

2.1 HI抗體平均值（見表2）

由表2 可知，作為不免疫對照組的F 組，抗體效價至21 d 仍小于1.0，表明免疫成功。免后7、14 d，B 組H5亞型和H7亞型HI抗體均高于其他試驗組；免后21 d，D、E組HI抗體效價效果較好，均不低于B、C 組。結果表明，免疫佐劑對抗體提升具有一定效果。

2.2 H5 亞型（Re-11 株）HI 不同組抗體變化檢測結果（見表2）

由表2可知，免后7、14 d，B組的禽流感H5亞型Re-11株的HI 抗體結果高于其他組；免后21 d，與A 組相比，B組、C組、D組和E組HI抗體效價均高約1.5～1.9個滴度。

2.3 H5 亞型（Re-12 株）HI 不同組抗體檢測測定結果（見表2）

由表2 可知，免后7 d，B 組禽流感H5亞型Re-12 株的HI抗體結果高于其他組；免后14 d，B組、C組和D組的HI抗體結果均略高于E組；免后21 d，與A組相比，B組、C組、D組和E組HI抗體效價均高約1.5～1.7個滴度。

2.4 H7 亞型（Re3 株）HI 不同組抗體變化檢測結果（見表2）

由表2可知，免后7、14、21 d，B組、C組、D組和E組H7亞型Re-3株的HI抗體無顯著差異；21 d結果顯示，各組HI抗體值在8.9～9.3之間，較A組高約0.9～1.3個滴度。

表2 HI抗體平均值（1∶X）Tab.2 Average value of HI antibody(1∶X)

3 討論

重組禽流感病毒滅活疫苗為強制免疫疫苗品種[13]，廣泛應用于蛋雞、肉雞和水禽等免疫，通過疫苗的免疫產生較高的抗體，從而達到對高致病性禽流感的預防作用[14-15]。如何能夠及時有效地產生和提升抗體，成為各企業和科研單位的公關方向。免疫佐劑是一類通過非特異性途徑提高機體對抗原或微生物特異性反應的物質[16-17]。本試驗通過應用相同含量抗原和不同含量抗原添加免疫佐劑制備禽流感疫苗進行效力檢驗，結果表明，30%抗原含量添加免疫佐劑組（B 組）在免疫后7、14 d 的HI 抗體效價略高于抗原含量低或未添加免疫佐劑的組別；免后21 d，添加免疫佐劑的不同抗原含量各組間HI抗體效價差異不顯著，并且較30%抗原含量不添加免疫佐劑組（A組）高約0.9～1.9個滴度。

4 結論

試驗結果表明，免疫佐劑能夠提高雞群對禽流感疫苗的免疫應答效果，降低抗原含量時還能夠保證21日效力檢驗的即時效價。由于本試驗依據禽流感效力檢驗方法進行抗體判定，所以對于免疫佐劑在降低抗原含量使用的情況下是否能夠達到4個月的免疫持續期，并保證抗體效價在6Log2 以上，仍需進一步監測跟蹤。同時，還需對雞群生產性能等指標進行監測，以驗證免疫佐劑的安全性。