單核細胞增生李斯特菌新疆流行株的毒力及耐藥性分析

張再超

（昌吉州動物疾病預防控制中心，新疆 昌吉 831100）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是人畜共患傳染病李斯特菌病的病原菌，廣泛分布于自然界[1]。李斯特菌病發病急，發病率較低，但病死率高，各種年齡、種類的動物以及人類均可感染發病，主要以幼齡動物和妊娠母畜較易感[2]。目前，已證實LM可感染綿羊、山羊、牛、豬、鹿、雞、兔、鼠、鴨、鵝、鸚鵡、北極狐等40多種動物。LM 可引起牛、綿羊、山羊以及豬等家畜發生腦膜腦炎、流產和急性敗血病[3-4]，也可導致禽類敗血癥和心肌壞死的發生，對我國畜禽養殖業造成較大的經濟損失。同時，LM作為一種重要的食源性細菌，能夠污染肉、奶、蛋等動物性食品，引起食品中毒，導致孕婦、新生兒及免疫力低下的成年人發病，對人類的健康也構成極大的威脅[5-6]。近年來，李斯特菌病廣泛流行于新疆綿羊群，對當地養殖業產生較大的經濟損失，通過動物性食品直接威脅人們的身體健康。此外，臨床上濫用抗菌藥物造成耐藥流行株出現，因此，本研究對LM新疆流行株的毒力、致病性和耐藥性開展試驗，為科學防治李斯特菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綿羊肝臟內分離得到單核細胞增生李斯特菌菌株LM-SB2 和LM-SB5，現由石河子大學人畜共患病實驗室保存；試驗小鼠購自石河子大學實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

試劑：BHK液體和固體培養基購自湖北泰康醫療設備有限公司；乙醇、二甲苯、石蠟、0.5%～1.0%伊紅乙醇溶液，均購自新百特化工公司；蘇木素染液購自湖北泰康醫療設備有限公司。

儀器：Pico17離心機（Thermo公司）、Pico17培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、KD-2260切片機（金華市科迪儀器設備有限公司）、NE910顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司）。

1.3 藥敏紙片

選用環丙沙星、四環素、萬古霉素、阿莫西林、阿奇霉素、克拉霉素、氨芐西林、新生霉素、諾氟沙星、頭孢唑啉、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、青霉素、氯霉素、鏈霉素、紅霉素共17種藥敏紙片，均由杭州天和微生物試劑有限公司生產，生產批號：090413。

1.4 試驗方法

1.4.1 LM-SB2和LM-SB5的培養及計數

將LM-SB2 和LM-SB5 接種至BHK 培養基，37 ℃培養24 h，采用平板菌落計數法分別對LM-SB2 和LM-SB5計數，測得LM-SB2 菌液濃度為4.30×109CFU/mL，LM-SB5菌液濃度為1.43×109CFU/mL。

1.4.2 LM-SB2和LM-SB5的LD50測定

LM-SB2和LM-SB5菌液分別3 000 r/min離心5 min，純化后，再分別以101、100、10-1、10-2、10-3濃度梯度進行稀釋。選擇66只小白鼠，隨機分為11組，每組6只，其中一組為對照組；分別將LM-SB2和LM-SB5各梯度濃度菌液腹腔注射至各組小鼠體內，每只小鼠注射量為0.1 mL，對照組腹腔注射等量的滅菌生理鹽水。接種后采取隔離飼養，1 w 內記錄小鼠死亡情況與細胞病變效應（CPE）情況，根據小鼠死亡數采用Read-Muench法計算兩種菌株的LD50。

1.4.3 LM-SB2和LM-SB5藥敏試驗

試驗根據美國臨床標準委員會（NCCLS）推薦K-B瓊脂法進行。挑取普通營養瓊脂平板上的LM-SB2 和LMSB5純培養菌落，懸于3 mL 生理鹽水，混勻后與菌液比濁管比濁。以白紙為背景，調整濁度與比濁管（0.5 MCF）相同。接種適量菌液均勻涂板，待平板上水分被瓊脂完全吸收后貼紙片，使用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm，菌接種后15 min 內貼完紙片。將平板反轉，37 ℃培養18～24 h后取出，測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數毫米數并記錄，抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限，判斷標準參照NCCLS 抗微生物藥物敏感試驗的執行標準（紙片擴散法）[7]。

2 結果與分析

2.1 LM-SB2和LM-SB5的LD50測定結果（見表1、表2）

由表1、表2可知，同劑量的菌液，在不同的稀釋度下，造成小鼠的死亡數不同，接種生理鹽水的對照組小鼠均未死亡。接種菌株LM-SB2的各組，死亡數與CPE數均隨濃度梯度降低而降低，濃度≤10-2時，死亡數與CPE數均為0；接種菌株LM-SB5的各組中，濃度為101時，該組小鼠全部死亡，且全部發生細胞病變。

表1 菌株LM-SB2接種小鼠后死亡、CPE情況Tab.1 Death and CPE situation of mice after inoculation with strain LM-SB2

表2 菌株LM-SB5接種小鼠后死亡、CPE情況Tab.2 Death and CPE situation of mice after inoculation with strain LM-SB5

根據小鼠的死亡數，計算測得菌株LM-SB2 和LMSB5的LD50分別為4.30×108.5CFU和1.43×107.5CFU。

2.2 LM-SB2和LM-SB5的藥敏試驗結果（見表3）

由表3 可知，LM-SB2 和LM-SB5 對氨芐西林、青霉素、亞胺培南均耐藥；對頭孢唑啉、四環素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、萬古霉素、新生霉素均敏感；對阿莫西林、諾氟沙星均中介。菌株LM-SB2 對環丙沙星敏感、對阿米卡星中介；菌株LM-SB5 對環丙沙星中介、對阿米卡星敏感。

表3 LM-SB2和LM-SB5的藥敏試驗結果Tab.3 Results of drug susceptibility test of LM-SB2和LM-SB5

3 討論

李斯特菌病一直是新疆綿羊養殖的潛在威脅。據調查，自1995年，新疆石河子、奎屯、伊犁等地區先后暴發李斯特菌病，造成大批羔羊死亡[8]。經過流行病學調查發現，該病主要發生在較寒冷地區及氣溫變化較大的春末與秋末。LM 廣泛分布于自然界，對低溫、紫外線、酸堿等環境因素具有較強的抵抗力，是重要的食源性人畜共患病病原[8-9]。不同地區的LM對動物機體的致病性存在差異，因此開展新疆地區單核細胞增生李斯特菌新疆流行株的毒力進行測定以及耐藥性檢測分析，對于掌握該病的流行病學以便采取有效防控措施具有重要意義。

LM的致病性與不同流行株的毒力有關[10-11]。本試驗采用腹腔注射接種的方法人工感染小鼠，測定兩種LM 毒株的毒力。結果表明，不同LM 流行株之間的毒力存在差異，菌株LM-SB5 的毒力是菌株LM-SB2 的30 倍，不同流行株之間的毒力差異也可作為一個實驗室診斷要點。

近年來，抗生素廣泛應用于畜禽生產，導致各LM菌株表現不同程度的耐藥性，給動物性食品的安全性及該病的防治工作造成巨大隱患。國內調查發現，LM 作為常見食源性細菌之一，在生肉、奶酪、雞蛋及肉制品等動物性食品中均有不同程度的污染，給人們的健康帶來了極大的威脅[12]。

通過對新疆單核細胞增生李斯特菌流行株LM-SB2和LM-SB5進行不同種類17種抗生素藥敏試驗發現，兩株LM新疆流行株對大多數β-內酰胺類抗菌藥物耐藥；對四環素類、大環內酯類、糖肽類、氯霉素類以及新生霉素抗菌藥物均敏感；對部分氨基糖苷類抗菌藥物敏感；對喹諾酮類耐藥性不明顯。藥敏試驗結果表明，同一種LM 流行株對不同種類抗菌藥物耐藥性存在差異，不同流行株對于同種抗菌藥物耐藥性也存在差異，如菌株LM-SB2對環丙沙星敏感，對阿米卡星表現中介；菌株LM-SB5 對環丙沙星中介，對阿米卡星敏感。因此，治療該病可根據當地流行株對抗菌藥物的耐藥性，針對性地選擇適宜的抗菌藥物，并注意防止產生交叉耐藥性。加強對單核細胞增生李斯特菌耐藥性監測力度，合理使用抗菌藥物，防止耐藥性進一步擴散，已逐漸成為關注的新課題[13-14]。

4 結論

本試驗對單核細胞增生李斯特菌新疆流行株的研究發現，不同LM 新疆流行株之間的毒力存在差異。LM 對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥性較強，因此，在畜牧生產當中，合理使用抗生素，優先考慮對LM敏感的抗菌藥物。