HIF-2α 在不同年齡段牦牛肺臟中的表達及分布

陳樹吾，楊 琨，姚一凡，張 蘭，鐘 文，喬自林，劉翊中*

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

青藏高原具有獨特的高寒、低氧環境。長期暴露在高原缺氧環境中的哺乳動物，易患肺高血壓、右心室肥大等高地疾病[1-2]。在低氧壓力下，機體低氧誘導因子表現的穩定性提高。低氧誘導因子2α（HIF-2α）是肺血管對急性和慢性低氧做出反應的重要調節因子，具有調控血管再生的功能，包括細胞增殖、血細胞成熟、血管生成、肺血管發育和胚胎發育等[3-4]。HIF-2α 的表達調節以蛋白質水平為主，HIF-2α是調節低氧生理機制的重要中樞，在低氧性肺動脈高壓的發病和進程中參與調節[5]。牦牛已在形態和生理上適應了青藏高原高寒、低氧環境。因此，本試驗采用免疫組織化學方法檢測了2 個年齡段牦牛肺臟HIF-2α 的表達，研究其分布特征，為了解高原低氧環境下的適應機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品于2019 年10 月份在甘肅省合作市屠宰場獲取，為各3頭份的3歲與6歲健康牦牛的肺臟組織，采用4%多聚甲醛溶液固定。

1.2 樣品處理

取1 cm3肺臟組織制成石蠟切片，切厚度為4～5 μm樣品貼附于載玻片，HE染色和免疫組織化學染色。

1.3 試驗試劑

多克隆抗體HIF-2α（bs-1447R）和抗兔SP 試劑盒（SP-0023），均購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB染色試劑盒（C02-04001），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 免疫組化檢測

石蠟切片置于40 ℃烤爐30 min 烤化石蠟，經脫蠟復水，PBS 洗滌5 min，抗原修復后利用SP 試劑盒阻斷封閉，滴加1∶100 比例稀釋的HIF-2α 兔多克隆抗體4 ℃孵育過夜（陰性對照組抗體為山羊血清）。次日，擦除一抗PBS浸泡滴加二抗，DAB 顯色液顯色適宜即終止反應，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，封片。

1.4.2 圖像采集及結果判定

利用光學顯微鏡觀察拍攝染色組織切片圖像，采用Image-Pro-Plus（6.0 版）定量檢測HIF-2α 的陽性表達結果。測量參數包括面積和積分光密度（IOD），并根據所測的IOD和所測區域面積得到平均光密度。

1.5 數據統計與分析

數據采用GraphPad Prism 8軟件進行統計學分析。對HIF-2α 平均IOD 值進行單因素方差分析，并對HIF-2α 進行方差分析平均，IOD 采用獨立樣本t 檢驗，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 牦牛肺臟的組織學結構（見圖1）

由圖1 可知，2 個年齡段牦牛肺臟的結構組織發育狀況良好，未發現病變部位。切片中可觀察到牦牛肺臟實質部分的組織分布明顯，較易區分。

圖1 牦牛肺臟的組織學結構Fig.1 Histological structure of yak lung

2.2 牦牛肺臟HIF-2α蛋白免疫組織化學染色（見圖2）

由圖2可知，3歲牦牛肺臟免疫組織化學染色中，末端支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中HIF-2α 蛋白呈陽性；HIF-2α 蛋白在6 歲牦牛肺臟的末端支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中呈強陽性，在肺血管和肌細胞中呈陽性。6 歲牦牛肺臟HIF-2α 在終末細支氣管的免疫染色強度強于3歲牦牛。

圖2 牦牛肺臟HIF-2α蛋白免疫組織化學染色Fig.2 Immunohistochemical staining of HIF-2α protein in yak lung

2.3 牦牛肺臟HIF-2α的平均光密度（見圖3、表1）

圖3 牦牛肺臟HIF-2α的平均光密度Fig.3 Average optical density of HIF-2α in yak lungs

表1 牦牛肺臟HIF-2α的平均光密度Tab.1 Average optical density of HIF-2α in yak lungs

由圖3、表1可知，6歲牦牛肺臟HIF-2α在終末細支氣管的免疫染色強度相與3 歲牦牛差異極顯著（P＜0.01），HIF-2α 在肺泡中3 歲和6 歲免疫組化染色結果與終末細支氣管中結果相似。

3 討論

牦牛肺臟結構與黃牛不同。牦牛肺的肺血液空氣屏障比黃牛更薄，有利于牦牛在高海拔低氧地區氣體交換過程中促進氧氣擴散[6]。低氧可迅速增加細胞內的HIF-2α蛋白含量，HIF-2α 可通過脯氨酸羥化酶和天冬酰胺羥化酶羥化途徑被降解，因此其活性受含氧水平調節[7]。HIF-2α可激活下游部分靶基因如促紅細胞生成素（EPO）、血管內皮生長因子（VEGF）等，低氧環境下EPO 與VEGF之間調節機體的生理病理反應有一定的功能相似性[5]。慢性低氧期還能夠增強HIF-2α 的穩定性[8]。在高原低氧環境下，HIF-2α進化速率最快，并且能夠調節下游靶基因和鐵代謝，降低了哺乳動物慢性高原病的發病率[9-10]。低氧條件下血管內皮細胞、肺成纖維細胞和上皮細胞中的HIF-2α表達量明顯高于常氧狀態[11]。

本研究結果顯示，6歲牦牛肺臟中HIF-2α的表達顯著高于3 歲牦牛。Ebersole 等[12]研究發現，恒河猴的黏膜組織中HIF-1α和HIF-2α與衰老呈正相關，其結果與本研究結果相似。HIF-2α還可通過破壞代謝穩態和線粒體凋亡誘導細胞抵抗凋亡[13-14]，也可能是因年齡增長，細胞凋亡增加而導致HIF-2α 表達量增加。正常環境中，HIF-2α 更多在一些組織器官胚胎發育時表達，在成人細胞中的表達量較少。姜華鵬等[15]研究表明，HIF-2α在細胞長期低氧適應性中起到重要作用，與本研究中隨著年齡增長，牦牛在低氧條件下生活時間與HIF-2α表達量呈正相關的結果相一致。牦牛隨著年齡的增長，肺臟中HIF-2α逐漸增加，遷移能力顯著上升，其抗損傷能力也隨之上升，以此滿足細胞增生，應對牦牛所生活的高原環境。

4 結論

本試驗通過在3 歲牦牛與6 歲牦牛肺臟中觀察HIF-2α表達分布情況，發現該蛋白于3歲牦牛肺臟組織中在終末支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中為陽性表達；在6歲牦牛肺臟組織中在終末支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中為強陽性表達，在肺血管和肌細胞中為陽性表達。低氧能夠促進HIF-2α 在牦牛肺臟中的表達，并隨年齡增長而上升，進而推測HIF-2α 因子對牦牛適應高原低氧環境具有重要作用。