肉牛場環境中枯草芽孢桿菌的16S rDNA 分離鑒定

王國艷，喬國峰，范建強，黨文慶，何 敏，張國權

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西 太原 030032；2.婁煩縣萬順源農牧發展有限公司，山西 太原 030300）

抗生素因能夠防止細菌性疾病發生、提高動物生長性能等優點，近年來廣泛應用于畜牧業[1-3]。但抗生素易在動物體內殘留，引起細菌等產生耐藥性，因此，尋找綠色的抗生素替代品成為熱點研究方向[2-4]。

枯草芽孢桿菌是一種好氧、嗜溫，并且能夠形成芽孢的細桿狀細菌，對營養需求較低，生長速度較快[5-7]，能夠在消化道中較為穩定地生長[8]，具有調節腸道菌群、抑制腸道中有害菌群生長的作用，可促進動物機體的免疫器官發育[9-10]。本試驗采集牛場飼料、干草、空氣、水源、糞便等樣品，分離得到菌株并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

山西省某肉牛養殖場的精補料、青貯飼料、水源、干草、糞便、空氣樣品。

1.2 培養基及試劑

LB肉湯液體培養基、普通營養瓊脂培養基、生化試劑管均（青島生物有限公司）；瓊脂糖（上海生物工程有限公司）。

PCR 引物、各型號tips（派諾森基因科技有限公司）；dNTP、TaKaRa LA TaqTM 聚合酶（TaKaRa有限公司）。

1.3 細菌的分離培養

在超凈工作臺上將飼料、水、干草分別放入LB肉湯試管，恒溫增菌培養16 h，將增菌液劃線接種于瓊脂平板，37 ℃培養16 h；將糞便劃線接種于瓊脂平板，37 ℃恒溫過夜培養；將牛舍中開蓋靜置3 min 的瓊脂平板蓋好蓋子，37 ℃恒溫培養過夜。觀察各平板的細菌生長狀態。

1.4 涂片鏡檢

挑取瓊脂平板上有褶皺的單菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.5 生理生化試驗

選取葡萄糖、乳糖、甘露醇、硫化氫等微量生化鑒定管，采用接種針穿刺待檢菌株接種于微量生化鑒定管中，37 ℃過夜培養，觀察并記錄。

1.6 藥敏試驗

采用KB紙片法，選取阿米卡星、頭孢哌酮、頭孢曲松、氧氟沙星、丁胺卡那、慶大霉素等臨床常用的6種藥物進行體外藥敏試驗，37 ℃培養20 h，測定抑菌環并記錄結果。

1.7 16S rDNA PCR基因序列測定（見表1、表2）

將用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取到的DNA 作為16S rDNA基因PCR擴增模板。根據GenBank數據庫查詢，用Primer6.0設計16S rDNA引物，由派諾森基因科技有限公司合成[11-12]。引物序列設計見表1。

表1 引物序列設計Tab.1 Primer sequence design

PCR擴增反應體系見表2。

表2 PCR擴增反應體系Tab.2 PCR amplification reaction system

反應程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環35次；72 ℃終延伸7 min。

2 結果與分析

2.1 細菌培養（見圖1）

由圖1可知，肉湯液體渾濁；空氣、水源、飼料、干草的瓊脂平板均無褶皺型單菌落生長；糞便接種的普通瓊脂營養平板上有乳白色、隆起、褶皺樣菌落生長。

圖1 瓊脂平板上的菌落Fig.1 Colonies on agar plates

2.2 顯微鏡下的菌落形態（見圖2）

由圖2 可知，顯微鏡油鏡下觀察為單個排列的革蘭陽性細長桿菌。

圖2 顯微鏡下的菌落形態Fig.2 Colony morphology under microscope

2.3 生化試驗結果（見表3）

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[13]、《常見細菌系統鑒定手冊》[14]，由表3 可知，待檢菌株的生理生化特性初步符合枯草芽孢桿菌。

表3 生化試驗結果Tab.3 Biochemical test result

2.4 藥敏試驗結果（見表4）

表4 藥敏試驗結果Tab.4 Result of drug sensitivity test

由表5可知，該菌株對6種藥物均表現出高度敏感，表明該菌株無耐藥性。

2.5 PCR擴增結果（見圖3）

由圖3可知，得到大小約為1 500 bp的目的條帶。

圖3 PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification result

2.6 16S rDNA鑒定結果

取各個菌種純化后的PCR 產物，使用測序儀ABI3730-XL 進行DNA 測序。采用NCBI Blast 程序將拼接后的序列文件與NCBI 16S 數據庫中的數據進行比對。結果表明，擴增序列與NCBI 公布的NR_112686.1 參考株同源性達99.93%，該分離株為枯草芽孢桿菌。

3 討論

近年來，為減弱因抗生素濫用造成的細菌耐藥、DNA污染等危害，益生菌制劑受到廣泛關注[15]。芽孢桿菌作為一類重要的生物防控菌株，已得到廣泛開發應用，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑，具有廣闊的應用前景[16-17]。杜漢宇等[18]認為，從動物機體及其存活的養殖環境中分離出來的益生菌與動物保持長期的共生狀態，具有相互選擇關系，易于在該類動物機體內定植，因此適合作為生態制劑加入飼料中。本研究從肉牛場糞便中分離出的枯草芽孢桿菌，可考慮應用于肉牛飼料添加劑，為肉牛養殖微生態飼料添加劑的開發提供候選菌株。

4 結論

本試驗采集肉牛場環境樣品，符合枯草芽孢桿菌的形態鑒定，鏡檢為細長的桿菌；16S 序列鑒定，PCR 擴增條帶為1 500 bp 左右，序列比對結果同源性達99.93%，鑒定為枯草芽孢桿菌。