基于多數(shù)據(jù)集分析10型膠原α1鏈和分泌型磷蛋白1在肺腺癌中的表達及臨床意義

劉美岑，劉蕾

解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科，沈陽 110016

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是腫瘤相關死亡的主要原因。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要組織學亞型，占肺癌患者的85%。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是最常見的 NSCLC 亞型。其中，LUAD是NSCLC中最常見的組織學亞型，占NSCLC的50%以上。大約70%的肺癌患者被診斷時為晚期，此時患者已經(jīng)錯過了接受手術、化療和放療的機會。中晚期就診、缺乏可靠的生物標志物、不精準的治療靶點已成為治療LUAD的主要障礙。因此，早期診斷和治療對于改善患者的預后和生活質量至關重要。10型膠原α1鏈（collagen typeⅩ alpha 1 chain，COL10A1）基因編碼的產(chǎn)物是10型膠原蛋白的α1鏈，是一種主要的間質基質成分。它通過形成同源三聚體，組成10型膠原蛋白。COL10A1在許多實體腫瘤中表達升高，如結腸癌、食管癌和乳腺癌，并在關鍵的細胞過程中發(fā)揮重要作用，如細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成。分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）是一種分泌型磷酸化糖磷蛋白，人類

SPP1

基因位于第4號染色體（4q13）上，有7個外顯子和6個內含子。該蛋白可由多種細胞分泌，如破骨細胞、巨噬細胞、上皮細胞和內皮細胞，涉及多種生物學功能。本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等數(shù)據(jù)庫中的基因組和臨床數(shù)據(jù)，運用生物信息學技術分析

COL10A1

、

SPP1

mRNA表達與LUAD診斷和預后的關系，預測COL10A1和SPP1參與LUAD發(fā)生發(fā)展的作用機制，探討COL10A1和SPP1在LUAD診斷及預后中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料收集

從TCGA公共數(shù)據(jù)庫（https://tcga-data.nci.nih.gov/）下載

COL10A1

和

SPP1

基因mRNA測序數(shù)據(jù)集及與之相一致的患者臨床資料。僅保留臨床資料和生存信息完整的病例，共納入LUAD患者594例。

1.2 表達差異分析

利用數(shù)據(jù)庫搜索COL10A1和SPP1在正常肺組織和LUAD組織中的表達情況，并進行比較。基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析

COL10A1

和

SPP1

基因在正常肺組織和LUAD組織中的表達差異、在不同分期LUAD組織中的表達差異及其與LUAD預后的關系。

1.3 生存分析

為明確COL10A1和SPP1表達在LUAD預后中的價值，采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析，應用“Auto select best cut off”方法[該方法計算基因高低表達四分位數(shù)之間所有可能的邊界值，并使用最佳性能閾值作為邊界值。結果中除了顯示

P

值外，還將顯示錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）]比較數(shù)據(jù)庫中COL10A1和SPP1的表達水平對719例LUAD患者生存期的影響。

1.4 免疫組化分析

人類蛋白質表達圖譜（the Human Protein Atlas，HPA）是基于RNA測序分析和免疫組化分析的大型轉錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/），可用于正常組織和腫瘤組織中蛋白差異表達分析。通過該網(wǎng)站分析

SPP1

基因在不同分級的LUAD組織中的表達。通過SPP1組化抗體（HPA027541）對正常肺組織和肺癌組織進行免疫組化檢測，分析3例正常肺組織和3例肺癌組織中SPP1蛋白表達及抗體染色程度。

1.5 預后影響因素分析

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫中較完整的325例LUAD患者數(shù)據(jù)信息，利用Cox回歸模型分析臨床特征、COL10A1和SPP1表達與LUAD預后的關系。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

為探討COL10A1和SPP1表達水平對相關生物通路基因集的影響，本研究分析與COL10A1和SPP1相互作用的蛋白網(wǎng)絡以及這些相互作用蛋白參與的生物學過程，進一步分析COL10A1和SPP1影響肺癌患者預后可能的作用機制，并通過GSEA分析不同表達水平的COL10A1和SPP1對多種生物通路基因集的影響。從分子標簽數(shù)據(jù)庫（molecular signatures database，MsigDB）中獲得參照（h.all.v7.4.symbols.gmt和 c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt）基因集，按default weight edenrichment statistic的方法，每個分析重復1000次。在GSEA中按

P

＜0.05且FDR＜0.25判斷顯著富集基因集。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）[

M

（

P

，

P

）]表示，組間比較采用秩和檢驗；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；采用Cox回歸模型進行單因素及多因素分析；以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中COL10A1和SPP1表達量的比較

針對535例LUAD組織和59例癌旁組織的統(tǒng)計學分析結果表明，LUAD組織中COL10A1和SPP1表達量均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01）。對57例患者的腫瘤組織與癌旁組織的分析結果表明，LUAD組織中COL10A1和SPP1表達量均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01）。（表1、表2）

表1 535例LUAD組織和59例癌旁組織中COL10A1和SPP1表達量的比較[M，（P25，P75）]

表2 57例患者的LUAD組織和癌旁組織中COL10A1和SPP1表達量的比較[M，（P25，P75）]

2.2 不同COL10A1和SPP1表達情況的LUAD患者生存情況的比較

分析Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中的719例LUAD患者的生存情況，結果顯示，COL10A1和SPP1高表達LUAD患者的生存期均明顯長于低表達患者，差異均有統(tǒng)計學意義[HR=0.51（0.40～0.66）、1.83（1.42～2.38），

P

＜0.01）]。（圖1、圖2）

圖1 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析中COL10A1高表達（n=290）與COL10A1低表達（n=429）LUAD患者的生存曲線

圖2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析中SPP1高表達（n=181）與SPP1低表達（n=538）LUAD患者的生存曲線

2.3 LUAD中SPP1特征的初步驗證

為驗證以上結果，本研究重點探討肺癌中SPP1蛋白表達情況。采用HPA公共數(shù)據(jù)庫中肺癌免疫組化標本評估SPP1的表達情況，且引用該數(shù)據(jù)庫中SPP1（組化抗體編號HPA027541）的免疫組化檢測結果，結果顯示，肺癌患者的SPP1特異性染色呈陽性，與正常肺組織中SPP1蛋白表達存在顯著差異。與正常肺組織相比，SPP1在LUAD組織中呈高表達（圖3）。

圖3 SPP1蛋白在正常肺組織與LAUD組織中的表達差異（免疫組化染色，×100）

2.4 LUAD患者預后影響因素的單因素及多因素分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫中共獲取325例LUAD患者信息，將其臨床特征以R語言處理。將年齡、性別、腫瘤分期、TNM分期、COL10A1表達、SPP1表達進行單因素分析及多因素分析，Cox多因素分析結果表明，腫瘤分期是LUAD患者預后的影響因素（

P

＜0.01）。（表3）

表3 預后影響因素的單因素和多因素分析

2.5 COL10A1和SPP1的功能基因集富集

GSEA富集分析結果顯示，COL10A1高表達的樣本富集了與血管新生、頂端連結、凝結、DNA修復、上皮-間充質轉變、脂肪酸代謝、KRAS信號上調、肌細胞生成、NOTCH信號、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路、致心律失常性心肌病、細胞因子受體相互作用、ECM受體相互作用、黏著斑、糖胺聚糖生物合成硫酸軟骨素、肥厚型心肌病、白細胞跨內皮遷移、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)有關的基因集（圖4A、圖4B）。SPP1高表達的樣本富集了與血管新生、細胞凋亡、凝結、補體、上皮-間充質轉變、糖酵解、組織缺氧、炎癥反應、mTORC1信號、Myc目標、糖酵解糖質新生、致病性大腸桿菌感染、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、蛋白酶體等有關的基因集（圖4C、圖4D）；在GSEA中按缺省加權富集統(tǒng)計方法進行富集分析，

P

＜0.05且FDR＜0.25的基因集判斷為顯著富集基因集。

圖4 GSEA分析COL10A1和SPP1相關富集基因集

3 討論

LUAD是最具侵襲性和快速致死性的腫瘤之一，其發(fā)病率在各種類型的肺癌中居第1位。發(fā)現(xiàn)LUAD特異性的早期診斷分子及治療靶標，對于指導LUAD患者早期診斷和干預治療、提高患者生存率、改善患者生活質量以及延長生存期具有著重要意義。

COL10A1是一種液態(tài)非纖維膠原，是分布在細胞間質中的主要間質基質成分。細胞外基質在腫瘤細胞的生長、分化、進展、凋亡和轉移中發(fā)揮重要作用。COL10A1在許多實體腫瘤類型中高表達，如結腸癌、食管癌和乳腺癌，并在許多關鍵的細胞過程中發(fā)揮重要作用，如腫瘤細胞的生長、增殖、遷移、腫瘤血管生成，此外，COL10A1還與腫瘤的不良預后相關。SPP1可能是多種腫瘤的潛在驅動因素。SPP1在多個腫瘤相關生物過程中發(fā)揮重要作用，包括增殖、侵襲、遷移、血管生成和轉移。在胃癌和食管癌中，SPP1的表達與腫瘤轉移密切相關。SPP1通過調節(jié)血管內皮生長因子的表達和細胞外基質蛋白促進腫瘤發(fā)展。SPP1調節(jié)腫瘤細胞的許多功能，如刺激腫瘤細胞增殖和侵襲、支持腫瘤血管生成。然而，COL10A1和SPP1蛋白在LUAD中的作用及其調控機制尚未得到很好的研究，COL10A1和SPP1在LUAD中的表達及與預后的關系尚不清楚。

本研究分析了COL10A1和SPP1在LUAD中的表達及與預后的關系，研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LUAD組織中COL10A1和SPP1高表達。分析結果表明，在LUAD中COL10A1和SPP1表達上升是導致預后較差的因素之一。本研究使用的數(shù)據(jù)庫樣本量大、臨床資料完整、可信度高。但是，數(shù)據(jù)庫提供的是

COL10A1

、

SPP1

mRNA變化情況，無法完全反映COL10A1和SPP1蛋白水平的變化情況。因此，應用HPA數(shù)據(jù)庫從蛋白質表達水平進一步證實了SPP1在LUAD中表達量升高。

為了推測COL10A1和SPP1在LUAD發(fā)展過程中的功能，本研究利用GSEA方法進行分析，結果發(fā)現(xiàn)COL10A1的表達與血管新生、TGF-β信號通路、肌細胞生成、黏著斑、頂端連接、ECM受體相互作用、DNA修復、KRAS信號上調、上皮-間充質轉變、NOTCH信號通路等相關。因此，COL10A1可能與腫瘤細胞生長和分化相關。另外，SPP1在血管新生、上皮-間充質轉變、組織性缺氧、mTORC1信號、糖酵解糖質新生、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、細胞凋亡、炎癥反應、蛋白酶體等通路中大量富集，提示SPP1可能與腫瘤的轉移、代謝和免疫功能相關。COL10A1和SPP1將成為LUAD治療的新潛在靶點。

綜上所述，LUAD樣本中COL10A1和SPP1的表達顯著增高，其功能可能參與腫瘤細胞生長和分化、腫瘤的轉移、代謝和免疫調節(jié)。該研究將為后續(xù)深入研究COL10A1和SPP1在LUAD中具體作用的分子機制提供重要的臨床數(shù)據(jù)支持和理論基礎。