胡瑞瑞，秦玉芬，張紅梅，王全義，洪豐

濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1消化內(nèi)科，2消化內(nèi)鏡室，3病理科，4肝病研究中心，山東 濟寧 272000

食管癌是消化道常見及高發(fā)的惡性腫瘤之一，目前因動物模型研究和開發(fā)的滯后，臨床上對食管癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫學(xué)機制尚缺乏深入系統(tǒng)的認識，嚴重影響疾病的精準治療與預(yù)后判斷。合適的動物模型是改變這一現(xiàn)狀的關(guān)鍵因素之一。近年來，腫瘤類器官培養(yǎng)體系突破性提高了腫瘤細胞在體外培養(yǎng)的效率并最大程度再現(xiàn)了腫瘤細胞在體內(nèi)的生物學(xué)特性，“基于類器官的惡性腫瘤疾病模型”被列為2021年“十四五”國家重點研發(fā)計劃之一。本研究在此基礎(chǔ)上，采用了新型3D微載體——microcarrier 6與人原代食管癌細胞共同孵育，構(gòu)建三維生長的“腫瘤類器官”，并進一步建立了患者來源的正常免疫功能小鼠移植瘤模型，為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)人源化動物模型的建立提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠40只，雄性，8周齡，體重24～25 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[實驗動物質(zhì)量合格證號37009200003571]，飼養(yǎng)于濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心，所有動物實驗過程均符合濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 食管癌標本

選取濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院4例食管癌患者的手術(shù)標本，術(shù)前胃鏡活檢病理及術(shù)后標本病理檢測均為鱗狀細胞癌。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，且所有患者均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.3 微載體

microcarrier 6由美國ELYON BioTechnologies LLC公司提供。該新型微載體呈多層孔狀結(jié)構(gòu)，由帶正電化的有機復(fù)合多聚物組成，不含雜質(zhì)，不易污染，具備低免疫原性、生物兼容性良好、可代謝性等優(yōu)點，能為細胞生長提供穩(wěn)定的微環(huán)境。

1.4 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、膠原酶B、10%胎牛血清、紅細胞裂解液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、青鏈霉素均購自美國Gibco公司。鼠抗人p40、CK5/6單克隆抗體均購自無錫東源公司。

1.5 人原代食管癌細胞分離與提取

食管癌標本于手術(shù)中取出后放置于無菌生理鹽水中，30 min內(nèi)送至實驗室進行處置。首先以無血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗標本3次，洗去表面血性物或糜爛物質(zhì)，將標本用組織剪機械性剪碎，加入0.05%膠原酶，放置于37℃溫箱中消化。每30～60 min觀察組織消化情況，并反復(fù)用移液管吹打。1 h后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液，稀釋并吹打組織混合物，以400 r/min離心5 min，留取上清，其余組織加入膠原酶繼續(xù)放置溫箱中消化。將取出的上清液加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，70 μm濾網(wǎng)過濾，以1200 r/min速度離心8 min，棄上清，加入紅細胞裂解液，30 min后加入DMEM培養(yǎng)液，以1000 r/min離心8 min，提取第一批食管癌細胞。以后重復(fù)上述步驟，提取消化2～3 h的食管癌細胞（圖1）。

圖1 人原代食管鱗狀細胞癌細胞提取及培養(yǎng)

1.6 三維細胞培養(yǎng)模型的建立

將microcarrier 6浸泡于75%乙醇中24 h，用1×PBS清洗3遍，于DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h；用基質(zhì)細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）對微載體進行修飾，孵育3 h，濃度調(diào)整為100 ng/ml。將提取的食管鱗狀細胞癌細胞放置于含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，吹打成單細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為2×10/ml，以細胞與載體約3∶1的比例加入微載體，然后放置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中孵育12～24 h，鏡下觀察細胞與微載體結(jié)合達飽和狀態(tài)（圖2）。

圖2 微載體及腫瘤細胞與微載體結(jié)合飽和后的狀態(tài)

1.7 動物模型制備及觀察指標

因食管癌標本大小有限，分4次實驗進行，每次用10只小鼠，按是否接種微載體與食管癌細胞復(fù)合物分為實驗組和對照組，每組各5只小鼠。實驗組將微載體與食管癌細胞復(fù)合物接種到正常免疫小鼠右側(cè)腋下，每只100 μl；對照組僅接種微載體，皮下種植到正常免疫小鼠右側(cè)腋下，每只100 μl。接種后觀察小鼠精神狀態(tài)、活動度、飲食情況，觀察記錄小鼠局部腫瘤的成瘤時間、腫瘤大小。腫瘤長出后每天測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)腫瘤體積公式V=1/2×a×b計算出腫瘤體積。18天后脫頸處死移植瘤小鼠，完整取出腫瘤組織，記錄腫瘤的體積、質(zhì)地以及壞死程度（圖3）。腫瘤組織用10%中性福爾馬林固定，送至病理科行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫組化染色，其中，免疫組化使用Envision二步法檢測反映人食管癌特征的p40、CK5/6。

圖3 移植瘤小鼠及移植瘤

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 接種后小鼠的一般狀況

實驗組接種2～3天后小鼠食欲變差、活動度減少、精神狀態(tài)變差，小鼠體重隨著生長日期的延長而略有增加，整個過程中無小鼠死亡，不同時間實驗組與對照組小鼠體重比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）（表1）。

表1 不同時間兩組小鼠體重及移植瘤直徑（±s）

2.2 成瘤時間及大小、成瘤率

實驗組：10～12天可在小鼠腋下觸摸到直徑大于0.4 cm的硬質(zhì)結(jié)節(jié)，13～18天結(jié)節(jié)生長迅速，成瘤直徑可達0.8～1.2 cm。于18天時脫頸處死移植瘤小鼠，取出異位腫瘤，發(fā)現(xiàn)瘤體多數(shù)呈圓形或橢圓形，質(zhì)地韌或硬，切開后發(fā)現(xiàn)腫瘤切面多為灰白色。成瘤率為80%（16/20）。

對照組：共有3只小鼠在解剖時于右側(cè)腋下發(fā)現(xiàn)0.3 cm左右的質(zhì)軟結(jié)節(jié)，剖開后見疏松的黃色載體物質(zhì)流出，其余對照組小鼠在生長過程中均未觸及異位腫瘤。

2.3 HE染色結(jié)果

移植瘤鏡下觀察可見大小不一、排列雜亂無章的異型細胞，細胞多呈橢圓形，細胞核大、畸形、深染，細胞質(zhì)中等，背景中可見淋巴細胞、異物巨細胞。鏡下亦可見腫瘤細胞侵及肌肉、神經(jīng)、脂肪等組織，在腫瘤中央可見壞死灶，腫瘤周邊見毛細血管分布。（圖4）

圖4 移植瘤鏡下圖（HE染色）

2.4 免疫組化檢測結(jié)果

實驗組免疫組化結(jié)果顯示p40、CK5/6表達陽性，證實異型細胞為人來源食管鱗狀細胞癌細胞。（圖 5）

圖5 移植瘤免疫組化圖（免疫組化染色，×20）

3 討論

食管癌是世界上病死率較高的惡性腫瘤。其病理類型大多數(shù)為鱗狀細胞癌，少部分為腺癌。目前對食管癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制研究尚不充分，合適的實驗動物模型能為疾病發(fā)病機制的探討、藥物新靶點的研究以及臨床前藥效學(xué)評價提供重要的平臺基礎(chǔ)，因此，理想動物模型的建立對成功開展轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)有重要意義。

長期以來，人類腫瘤細胞系和移植瘤裸鼠動物模型一直作為腫瘤研究和抗癌新藥研發(fā)的主要平臺，但由于細胞系所形成的腫瘤組織缺少間質(zhì)細胞，而間質(zhì)細胞在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，因此很難準確模擬臨床患者的真實病情。近年國外學(xué)者將患者的新鮮腫瘤手術(shù)標本移植到免疫缺陷小鼠，建立了新的模型，命名為腫瘤患者來源的移植瘤模型。這些模型成功地再現(xiàn)了患者腫瘤的分子生物學(xué)、組織學(xué)和病理學(xué)特點。

本實驗前期階段單純以人原代食管癌細胞接種于小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即便增加細胞數(shù)量，也無法生長出移植瘤，考慮為人鼠異種移植排斥反應(yīng)所致。3D微載體體系彌補了上述缺陷，該微載體是一種支持細胞生長的支撐物，由帶正電化的有機復(fù)合多聚物構(gòu)成，具備多層孔隙結(jié)構(gòu)，質(zhì)地疏松，有利于細胞的快速附著和擴增，且可在短時間內(nèi)起到屏障作用，阻擋免疫細胞直接殺傷腫瘤細胞，并且經(jīng)VEGF和SDF-1α修飾后，能夠誘導(dǎo)血管長入，為腫瘤的快速增長提供營養(yǎng)。以上條件均為腫瘤細胞的穩(wěn)定生長提供良好的基礎(chǔ)。3D腫瘤細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠模擬腫瘤生長的微環(huán)境，已成為目前研究的熱點。

在此基礎(chǔ)上，本實驗采用了人原代食管鱗狀細胞癌細胞與新型3D微載體——microcarrier 6共同孵育，構(gòu)建三維生長的“腫瘤類器官”，進而建立了患者來源的正常免疫小鼠移植瘤模型，彌補了因免疫缺陷小鼠缺乏免疫細胞（特別是T淋巴細胞）而不能準確模擬機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫攻擊等重要缺點，從而更準確地還原患者腫瘤組織的分子生物學(xué)和組織學(xué)特點及腫瘤微環(huán)境。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于microcarrier 6復(fù)合人原代食管鱗狀細胞癌細胞構(gòu)建正常免疫小鼠移植瘤模型的成瘤率為80%。該模型的特點是腫瘤成瘤較快，重復(fù)性良好，操作相對簡便。在本實驗造模方法中，提出下列關(guān)鍵因素：①標本處理，手術(shù)標本盡量貼近無菌環(huán)境，標本取出后放置無菌生理鹽水或DMEM培養(yǎng)液中，標本取出后盡快處理，以免細胞過多失活或死亡。②提取細胞，膠原酶濃度定為0.05%，前期預(yù)實驗階段曾提高膠原酶濃度，發(fā)現(xiàn)消化時間稍長時，細胞會死亡或處于失活狀態(tài)，細胞消化時間一般不超過4 h。③腫瘤細胞與微載體飽和狀態(tài)，該項是造模成功的最關(guān)鍵因素，分離提取的腫瘤細胞要與微載體孔徑充分飽和，這樣在異位接種時才能更好地生長。腫瘤細胞與微載體孵育時間一般為12～24 h，期間要多次顯微鏡下觀察二者的飽和狀態(tài)。本實驗顯示，移植瘤在10～12天就可長出，13～18天為其生長高峰期。病理學(xué)HE染色提示大量異型核細胞的浸潤生長，可侵及脂肪、肌肉、神經(jīng)等組織，腫瘤中央因腫瘤細胞生長過速，血供不足，看見壞死灶，在腫瘤周邊還可以看見毛細血管分布。這些均符合人腫瘤生長特點。免疫組化檢測則顯示p40、CK5/6表達陽性，進一步證實異型細胞來源于人食管鱗狀細胞癌細胞。

綜上所述，本實驗基于3D微載體在正常免疫功能小鼠成功建立了移植瘤動物模型，該模型保留了小鼠正常免疫功能體系及人源性腫瘤的特點，為新型造模方法提供了思路，可待進一步探究與擴展。