基于網絡藥理學當歸黃柏治療慢性前列腺炎的作用機制研究?

劉勝京，郭 軍，王 福，張繼偉，晏 斌，杜冠潮，高慶和△

(1. 中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091； 2. 北京中醫藥大學，北京 100029)

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是臨床常見病、多發病。據報道，35%～50%的男性曾受到CP癥狀的影響[1]。國外1項10600人的調查顯示，CP的發病率為8.2%[2]。國內關于CP的流行病學研究因調查方法及調查人群的不同，發病率差異較大，處于6%～-32.9%之間，高于國外的文獻報道[3]。隨著環境、社會及生活方式的改變，CP發病率有逐年增高趨勢[2]。目前西醫治療CP主要以抗生素、α受體阻滯劑、非甾體抗炎藥為主，多為經驗性治療，治療效果不佳，尚無治療CP的有效藥物[4]。CP屬于中醫學“精濁”“淋濁”“白淫”等范疇，臨床實踐證明中醫藥是治療CP的重要方法之一。

本研究前期通過臨床經驗總結及數據挖掘中國中醫科學院首席研究員、中國中醫科學院西苑醫院男科主任郭軍教授治療CP的用藥處方規律，發現當歸-黃柏為治療CP的核心藥對，且郭軍教授基于“瘡瘍內消法”以當歸和黃柏為君藥，擬定方劑歸黃方，臨床多獲良效[5]。郭軍教授認為，當歸質潤性動，活血行滯止痛；黃柏性寒潤降，清熱瀉火燥濕，此藥對活血、清濕熱之功著，清熱而不傷陰，活血以消瘀滯，對濕熱瘀滯型CP有較好效果。現代藥理學研究表明，當歸提取物具有鎮痛、抗炎、抗凝作用，并可提高熱刺激致痛的痛閾[6]。黃柏抑制金黃色葡萄球菌效果較強，有抗炎、免疫調節、抗氧化作用[7]。目前關于CP的機制研究主要集中在炎癥免疫應答調節機制，其中對于導致炎癥反應的基因及作用機制研究日益受到重視[8]。

網絡藥理學是一種基于系統生物學理論，對藥物有效成分進行多靶點、多途徑生物系統網絡分析的方法[9]。本研究通過網絡藥理學探討當歸-黃柏多成分、多靶點、多途徑的作用特點，預測當歸-黃柏治療CP的可能作用機制，為進一步分析其活性成分和作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 當歸-黃柏活性成分及靶點的篩選

應用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/)檢索當歸、黃柏的所有活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，并在中國知網及PubMed數據庫中查閱當歸、黃柏目前已研究的主要相關活性成分進行補充。

根據已經得到的化合物，通過TCMSP數據庫對其成分進行打靶提取，對于補充得到的化合物，首先在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取化合物對應的SMILES結構，并錄入pharmmapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進行靶點垂釣，匯總去重后得到當歸-黃柏的最終預測靶點，并在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中將種屬選擇“Homo sapiens”對靶點進行標準化處理。

1.2 CP的疾病靶點

通過Genecards數據庫(http://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://www.omim.org/)檢索CP的疾病靶點，檢索詞為“chronic prostatitis”，匯總整理后去重得到CP對應靶點。

1.3 藥物與疾病共同靶點篩選

應用R語言軟件(https://www.r-project.org/)對校正后的藥物靶點及疾病靶點進行取交集處理，得到藥物與疾病的共同靶點。

1.4 可視化網絡圖構建

將藥物活性成分、藥物和疾病共同靶點的節點文件等導入Cytoscape 3.5.1軟件，構建藥物-活性成分-靶點-疾病的可視化網絡圖。通過拓撲網絡展示當歸-黃柏活性成分與CP間相互作用的關系。

1.5 蛋白互作網絡構建

應用STRING平臺(https://string-db.org/)構建(protein-protein interaction，PPI)網絡，將最低相互閾值設為0.95。應用R語言軟件將出現頻次前20的基因繪制條形圖。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

利用David網站(https://david.ncifcrf.gov/)，將中藥調控網絡中的基因symbol轉換為基因ID。利用R語言軟件通過基因功能注釋(gene ontology，GO) 和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)對核心靶標進行基因功能及通路的注釋分析，并將結果以條形圖或氣泡圖形式呈現，根據核心通路富集程度探究當歸、黃柏治療CP可能的作用機制。以上R包的下載通過R3.6.1以及Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)。

2 結果

2.1 當歸、黃柏活性成分及靶點

通過TCMSP數據庫以OB≥30%且DL≥0.18為標準篩選當歸、黃柏的活性成分，去重后共得到38個活性成分。通過檢索當歸與黃柏藥理學研究的相關文獻對所得成分進行分析，發現當歸中的Ligustilide、Butylidenephthalide、glucuronic acid、galacturonic acid、Ferulic Acid、senkyunolide、vanillic acid、neocnidilide，經多篇文獻研究發現具有較高的生物學活性，故將其納入潛在活性成分進行分析[6, 10]。通過TCMSP及pharmmapper數據庫對所得活性成分進行靶點預測，去重后通過Uniprot數據庫進行校正。

最終篩選后共得到當歸-黃柏的46個活性成分、212個校正靶點，其中當歸主要包括揮發油類、有機酸類、甾醇類、內酯類等共10個活性成分，作用靶點140個；黃柏主要包括生物堿類、甾醇類、黃酮類等共37個活性成分，作用靶點98個；共同活性成分1個，為β-谷甾醇(beta-sitosterol)。

2.2 CP的疾病靶點篩選

通過檢索GeneCards、OMIM數據庫得到CP的疾病靶點，分別篩選到7376個和23個靶點，經過去重共得到7397個CP的疾病治療靶點。

2.3 藥物與疾病共同靶點篩選

應用R語言軟件對校正后的藥物靶點及疾病靶點取并集獲得共同靶點，共同靶點數為159個。

2.4 可視化網絡圖構建

將藥物活性成分、藥物和疾病共同靶點等導入Cytoscape 3.5.1軟件，構建藥物-活性成分-靶點-疾病的可視化網絡圖共包括191個節點，其中靶點159個，活性成分30個，疾病和藥物各1個。圖中橙色代表藥物，綠色代表活性成分，藍色代表藥物與疾病相互作用靶點，墨綠色代表疾病，相連的邊表示藥物、成分與疾病靶點的互相作用關系(見圖1)。

圖1 藥物-活性成分-靶點-疾病互作網絡

圖2 共同靶點蛋白互作網絡

2.5 PPI互作網絡構建

將共同靶點輸入STRING平臺，構建共同靶點PPI互作網絡，選取置信度高于0.95的數據得到PPI網絡圖(見圖2)。應用R語言軟件統計出現頻次前20的靶點并繪制條形圖(見圖3)。通過PPI互作網絡分析可見蛋白互作頻次較高的有腫瘤抑制基因(TP53)、表皮生長因子受體(EGFR、ESR1、EGF)、核受體輔激活蛋白1(NCOA1)、特異性周期蛋白D1(CCND1)、白介素6(IL6)、凋亡信號分子(CASP3，CASP8)等，是整個網絡的節點蛋白。

圖3 當歸-黃柏治療CP核心基因

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析

對所獲得的當歸-黃柏差異基因進行富集分析，從生物途徑(biology process，BP)、細胞定位(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)對基因進行注釋和分類，得到基因富集情況的柱狀圖(見圖4)。對共同靶點進行KEGG通路富集分析，得到通路富集的氣泡圖(見圖5)。在柱狀圖及氣泡圖中，柱狀圖高度/圓圈的大小代表富集的數目，顏色代表富集的顯著程度，P值越小顯著程度越高、顏色越紅。排除廣泛通路后，選出排名前10的信號通路進行分析(見表1)。經文獻檢索結合前期研究，最終選出3條與當歸-黃柏治療CP最可能相關的核心信號通路，分析其核心基因數目、名稱及來源(見表2)。

3 討論

本研究經初步篩選得到當歸-黃柏46個活性成分，其中當歸的主要活性成分為藁本內酯(ligustilide)。藥理學研究證實，其能抑制多種炎性因子表達抗炎作用，實驗證明藁本內酯對CP模型大鼠的前列腺病理和痛覺敏感性有改善作用[11-12]。黃柏活性成分中口服利用度最高的化合物為鹽酸巴馬汀(palmatine，OB=64.6%)，藥理學研究證實，具有抗細菌、病毒、真菌感染以及抗癌作用[13]。活性成分中類藥性較高的化合物為甲基黃連堿(Worenine，DL=0.87)和黃連堿(coptisine，DL=0.86)，具有抗炎、抗氧化的作用[14]。《神農本草經》謂當歸“諸惡瘡瘍，金創，煮飲之”[15]，《本草綱目》謂黃柏“口舌生瘡，用黃柏含之良”“兩股生瘡，其汁淋瀝，用黃柏末摻之，立愈”[16]。本草古籍所載與實驗結果在一定程度上有吻合之處，具有一定參考價值。除度值較高的靶點，當歸-黃柏藥對還有許多成分、靶點與其他疾病有關，值得進一步挖掘。

表1 當歸-黃柏靶點通路富集結果比較(前10)

圖4 當歸-黃柏活性成分治療CP的關鍵靶點GO富集分析柱狀圖

圖5 KEGG 通路富集氣泡圖

表2 核心信號通路靶點富集比較

根據篩選出的46個活性成分，預測相關靶點212個，通過與疾病靶點取交集處理發現，兩者的共同靶點有159個，說明當歸-黃柏治療CP的覆蓋范圍較廣，藥物靶向性較好。通過PPI網絡分析，得到蛋白互作頻次較高的基因，主要包括癌癥相關基因(TP53)、表皮生長因子(EGFR，ESR1，EGF)、炎癥基因(IL-6)、凋亡信號分子(CASP3，CASP8)等。目前研究表明，CP中表皮生長因子EGFR、EGF表達情況明顯高于正常前列腺組織，與CP的發病呈正相關[17-18]。細胞因子IL-6能夠激活淋巴細胞分化，增強自然殺傷細胞的作用，且CP患者精漿中IL-6變化水平可作為CP的1項預測指標，對CP的診斷具有一定價值[19]。

基因功能注釋分析結果顯示，差異基因最可能相關的生物途徑主要涉及異源生物刺激反應、類固醇激素反應、抗生素反應、氧化相關反應等；分子功能主要涉及膜筏、膜區、膜微區、突觸前膜和突觸后膜成分、轉錄因子復合體、核染色質等，細胞定位主要涉及DNA結合轉錄激活、泛素樣蛋白連接酶結合、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性等。

通路富集分析結果提示，當歸-黃柏可能涉及表1中多條信號通路，其中與表2中的PI3K-Akt信號通路(22個靶點)、MAPK信號通路(15個靶點)、HIF-1信號通路(13個靶點)作用關系相對更為密切。對此3條信號通路分析顯示，在與治療CP相關的機制中，當歸-黃柏的多成分均參與作用，體現了中藥多途徑的治療特點，也體現了當歸-黃柏藥對治療的協同作用。PI3K-Akt信號通路參與調控細胞的增殖、分化凋亡等，與炎癥、腫瘤和生殖系統疾病密切相關。通過抑制PI3K-Akt信號傳導通路的活化以及上下游調質的釋放，可減輕炎癥痛及神經病理性疼痛[20-21]。MAPK信號通路是介導細胞內外信號傳導的重要系統，其家族信號通路包括P38MAPK、ERKs、JNK/SAPK、ERK5/BMK1，參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程，并與炎癥、腫瘤等密切相關[22-23]。其中p38 MAPK信號通路與炎癥、應激反應的調控更為密切，被認為是細胞信息傳遞的交匯點和共同通路[24]。目前有實驗及研究表明，p38MAPK通路抑制會使大鼠機械和熱痛的痛閾下降，并能調控IL-6、TNF-α等多種細胞因子抑制炎癥細胞的聚集或活化[25-26]。當歸-黃柏可能涉及調控PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信號通路，通過調控細胞增殖與凋亡、氧化與抗氧化等生物學過程治療CP。

本研究通過網絡藥理學的分析方法，篩選當歸-黃柏藥對的活性成分及作用靶點，構建網絡圖進行分析，并進一步預測當歸-黃柏治療CP的關鍵調控靶點與相關通路，體現當歸-黃柏對CP多成分、多靶點、多途徑的治療特點，為CP的治療提供思路借鑒，為進一步實驗驗證其作用機制提供理論依據。