真武湯治療慢性心力衰竭的網絡藥理學研究?

高 攀，張 姍，焦巨英，婁 妮，李 希，王幼平Δ

(1. 河南中醫藥大學第一臨床醫學院，鄭州 450000； 2. 虞城縣人民醫院，河南商丘 476300； 3. 大連醫科大學中西醫結合研究院，遼寧大連 116044； 4. 大連醫科大學檢驗醫學院， 遼寧大連 116044)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是指持續存在的心力衰竭狀態，是各種心臟疾病發展的終末階段，隨著年齡增長，其發病率呈上升趨勢[1]。目前臨床多采用正性肌力藥、利尿劑、擴張血管等藥物進行對癥治療，但效果不甚理想[2]。

真武湯源于《傷寒論》，由附子、生姜、白術、茯苓、白芍組成，具有溫陽利水的功效，主要治療陽虛水泛證，如心下悸動、小便不利、四肢沉重疼痛、浮腫、以腰以下為甚。有研究證明，真武湯結合西藥治療能明顯改善慢性心力衰竭患者的臨床癥狀[3]。雖然真武湯治療慢性心力衰竭效果較好，但其作用機制的研究也僅局限于單個蛋白水平[4]，難以體現真武湯多成分、多靶標的作用機制及中醫藥整體性特點[5]。

隨著生物信息學的發展，網絡藥理學為中醫藥系統性研究奠定了基礎。網絡藥理學將系統的網絡分析與藥理學相結合，深入研究方劑中藥與疾病之間的復雜機制[6]。同時網絡藥理學分析方法也體現了中藥“多成分-多靶標”的作用特點，便于更好地理解中藥之間的協同作用和進一步研究“中藥-疾病”之間的關系。本研究通過對真武湯有效成分的篩選，預測相關靶標通路，以探討真武湯治療慢性心力衰竭的作用機制。

1 材料與方法

在本課題實驗研究中，網絡藥理學分析方法總體來說可以分為以下幾步：(1)真武湯中各味藥物所含化學成分的數據庫建立；(2)通過口服吸收利用度和藥物相似性對成分進行篩選；(3)成分相關靶標的預測；(4)慢性心力衰竭相關靶標的搜索；(5)潛在靶標的選擇，蛋白質相互作用關系網絡的構建和通路分析(圖1)。

1.1 數據庫與軟件

采用中藥系統藥理學分析平臺數據庫(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP) (http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、韓國傳統知識門戶數據庫(korean traditional knowledge portal, KTKP) (http:∥www.koreantk.com/ktkp2014/)、有機小分子生物活性數據庫PubChem (https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction數據庫(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)、化學物質相互作用搜索工具(STITCH) (http:∥stitch.embl.de./)、蛋白質數據庫 UniProt (https:∥www.uniprot.org/)、藥物靶標數據庫(therapeutic target database, TTD) (http:∥bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man, OMIM) (http:∥omim.org/)、基因疾病大集合數據庫(DisGeNET) (http:∥www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、人類基因數據庫 GeneCards (https:∥www.genecards.org/)。網絡可視化軟件采用Cytoscape3.2.1 (http:∥www.cytoscape.org)；蛋白質互作網絡數據庫STRING (https:∥string-db.org/)、生物學信息注釋數據庫(database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID) (https:∥david.ncifcrf.gov/home.jsp, V6.8)、蛋白晶體結構數據庫(PDB) (https:∥www.rcsb.org/)，在線系統分子對接(http:∥systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)。

圖1 網絡藥理學分析流程圖Fig.1 Workflow of network pharmacology analysis

1.2 真武湯成分的獲取與數據庫建立

通過計算系統生物學實驗室平臺 (TCMSP)[7]和韓國傳統知識門戶數據庫 (KTKP)[8]，獲取中藥化學成分信息，建立真武湯化學成分數據庫?；瘜W結構等信息均使用PubChem進行確認。

1.3 藥代動力學ADME 評價

所有成分均通過TCMSP數據庫中納入的ADME信息進行篩選，沒有ADME信息的成分從數據庫中刪除。研究中使用ADME篩選標準為：口服生物利用度(OB) ≥30% 和 藥物相似性(DL) ≥0.18[9]。

1.4 成分靶標預測

基于所篩選的成分，從PubChem數據庫中得到成分相關的InChI Key、Canonical SMILES和CAS number。利用Swiss Target Prediction[10]和STITCH[11]數據庫對成分進行靶標預測，種屬設置為“Homo sapiens”，綜合閾值得分≥0.4，基因名稱、基因ID和種屬等信息使用蛋白質數據庫 (UniProt)[12]確認。

表1 真武湯中5種中藥成分篩選比較

1.5 慢性心力衰竭相關疾病靶標的預測

以“慢性心力衰竭”為關鍵詞，從OMIM 數據庫[14]、DisGeNET 數據庫[15]和GeneCards數據庫[16]中獲得疾病相關靶標，把上述4個數據庫中得到的靶標匯總作為疾病靶標。

1.6 網絡的構建

通過Cytoscape3.2.1[17]軟件進行網絡圖的構建，在一個網絡圖中，“節點”可表示中藥、成分、靶標、疾病、通路，“邊”代表各個節點之間的相互作用關系，節點的“度”表示與之相連邊的數目，節點的度值越大則說明這個節點在網絡圖中的重要性越大[18]。

1.7 潛在靶標的選擇與分析

將成分靶標映射到慢性心力衰竭疾病靶標上，獲得真武湯治療慢性心力衰竭的潛在靶標，把潛在靶標輸入蛋白質互作網絡數據(STRING)獲得蛋白-蛋白之間的相互關系(protein-protein interaction，PPI)，利用Cytoscape3.2.1構建PPI網絡圖。利用STRING[19]、DAVID[20]和KEGG數據庫[21]對潛在靶標進行功能富集分析，進一步闡明真武湯的作用機制。設定種屬為“Homo sapiens”，根據通路富集結果，以P<0.05作為顯著功能的臨界值，利用Cytoscape3.2.1構建中藥-成分-靶標-疾病-通路的網絡圖。

1.8 分子對接

基于網絡藥理學分析結果，利用蛋白晶體結構數據庫(PDB)獲取蛋白結構，利用在線分子對接網站(Systems Dock)對相關靶標蛋白和成分進行分子對接。Systems Dock是一個基于網絡藥理學預測和分析的在線服務器，能夠通過高精度對接模擬和分子路徑圖來全面描述配體選擇性，并說明配體如何作用于復雜的分子網絡。對接結果的分數是指實驗解離/抑制常數值 (PKD/PKI) 的負對數, 分子對接分數值通常為0～10。

2 結果

2.1 成分獲取

真武湯由白芍、白術、茯苓、附子和生姜5種中藥組成。通過TCMSP和KTKP數據庫查詢共搜索到421個化合物，其中白芍126個，白術75個，茯苓35個，附子65個，生姜120個。

2.2 化合物篩選

“ADME”指機體對外源化學物吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)的過程。以藥物代謝動力學為基礎分析預測有助于理解分子機制。因此，利用藥代動力學參數OB和DL值對化合物進行篩選。以OB ≥30% 和 DL ≥0.18篩選得到421個化合物中有73個符合標準。在這2個標準之外，五沒食子酰葡萄糖(pentagalloylglucose)[22]、土莫酸(tumulosic acid)[23]和姜酚 (6-gingerol)[24]也作為活性成分進行后續分析，最終選擇的化合物結果見表1。

2.3 化合物靶標的預測與網絡構建

Swiss Target Prediction是一個在線服務器，能夠與已知配體的二維和三維相似性測量相結合，精確預測生物活性分子的目標。STITCH整合了代謝途徑和晶體結構，并結合實驗和藥物靶向關系的相互作用信息，利用表型效應、文本挖掘和化學結構相似性等信息進行預測。在Swiss Target Prediction和STITCH數據庫中，預測的化合物和基因之間相互作用歸因于“綜合閾值得分”，分數越高表明相互作用越強，中藥、成分、預測靶標和綜合閾值得分如表2所示。刪除重復之后，共有120個基因與16個已鑒定化合物之間的綜合閾值得分≥0.4。根據預測結果構建化合物-靶標網絡圖(圖2)，包括139個節點和178條邊。

表2 化合物靶標預測比較

表3 潛在性靶標通路分析結果

注：藍色四邊形代表成分，紅色橢圓形代表靶標圖2 成分-靶標網絡圖

2.4 潛在靶基因的選擇與分析

以“慢性心力衰竭”為關鍵詞搜索疾病相關靶標，共得到8215個靶標結果。利用Cytoscape 3.2.1的merged功能選出成分靶標和疾病靶標的交集作為潛在靶標。以潛在靶標為核心，構建成分-潛在性靶標的網絡圖(圖3)，此網絡圖由15個化合物和101個靶基因組成。圖中山柰酚和53個靶標相連接，具有最高的度值。羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)、雄激素受體(AR)、芳香化酶(CYP19A1)與5個以上成分相連，這些成分和靶標可能是網絡圖中的關鍵節點。

注：藍色四邊形代表成分，紅色橢圓形代表靶標圖3 成分-潛在性靶標網絡圖

利用STRING數據庫對101個潛在性靶標進行分析，構建PPI網絡篩選出靶標97個，在Cytoscape 3.2.1進行可視化處理(圖4)。前列腺G/H 合成酶2 (PTGS2)、 表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、一氧化氮合酶(NOS3)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和基質金屬蛋白酶(MMP9)，芳烴受體(AHR)、雄激素受體(AR)和芳香化酶(CYP19A1)擁有較高的度值。在PPI分析結果中，節點的平均度值為9.29，PPI enrichment p-value< 0.01，提示分析結果可靠性高[18]。

注：紅色圓形代表潛在性靶標，度值和大小成正比圖4 潛在性靶標相互作用關系 (PPI)網絡圖

為探究潛在性靶標功能，利用STRING和 DAVID數據庫對潛在性基因進行功能富集分析(表3)，并建立中藥-成分-靶標-疾病-通路的網絡圖(圖5)，得到PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗通路、PPAR 信號通路、雌激素受體信號傳導等通路。目標基因主要涉及一氧化氮合酶(NOS3)、表皮生長因子受體(EGFR)、糖原合成酶激酶(GSK3B)和前列腺G/H 合成酶2 (PTGS2)等。

注：六邊形代表中藥，四邊形代表成分，橢圓形代表靶標，三角形代表疾病，“V”形代表通路圖5 中藥-成分-潛在性靶標-通路-疾病網絡圖

2.5 系統分子對接

基于上述網絡藥理學分析結果，我們對11個靶標(AHR、AR、PTGS2、CYP19A1、CYP51A1、EGFR、ESR1、GSK3B、MMP9、NOS3、PPARG)和山奈酚進行分子對接(圖6)。一般認為，分值大于4.25表示分子與靶標之間有一定的結合活性, 大于5.0表明有較好的結合活性, 大于7.0則說明結合活性很強[25]。這些結果表明，通過網絡藥理學篩選出的靶標均具有較好活性。

圖6 分子對接得分

3 討論

本文探討了真武湯通過15個成分和97個潛在性靶基因發揮治療慢性心力衰竭的作用。通過對潛在靶基因的功能富集分析得到可能作用的具體通路和主要涉及的目的基因NOS3、GSK3B、PTGS2等(圖7)。

圖7 真武湯中主要作用成分及靶標

通過網絡的構建與分析，山柰酚在真武湯中的度值比較高，發揮的作用比較大。山奈酚是植物中提取的黃酮類化合物， 它可以從葡萄柚、花椰菜、蜂膠、金縷梅等植物中獲得[26]。研究顯示，含山奈酚的植物具有抗炎、抗氧化、抗血脂和抗癌的作用[27]。在研究山奈酚對異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷的影響中，通過對血流動力學、心肌梗死面積、心肌損傷標志物、脂質分布、氧化應激、促炎細胞因子和心、肝組織病理學等方面進行評估，結果山奈酚預處理的大鼠在心肌梗死面積和心率上均得到降低，同時血清LDH、CK-MB、肌鈣蛋白和血脂水平也得到明顯改善[28]。在慢性心力衰竭合并糖尿病的條件下，山奈酚可通過降低血糖、血清心臟標志物、氧化應激、炎癥和細胞凋亡發揮治療作用[29]。因此，山奈酚可作為治療慢性心力衰竭方面的潛在藥物。

在PPI網絡圖的主要靶基因中，前列腺素G/H合成酶2 (PTGS2/COX-2) 的度值最大，提示其在慢性心衰治療中發揮著重要作用。長期使用COX-2選擇性抑制劑會增加患者心血管事件(心力衰竭、高血壓和心肌梗塞等)的發生風險[30]，所以COX-2在人類心臟病中的發展引起越來越多的關注。臨床試驗證明，昔布類藥物能夠抑制COX-2，降低炎癥介質的產生，但同時也降低抗血栓前列腺素類的生成，使心血管事件發生率增加[31]。此外，心肌細胞特異性COX-2轉基因模型對缺血/再灌注損傷具有保護作用[32]。研究表明，在異丙腎上腺素誘導大鼠心衰病程中加以中藥的應用，可以通過調節COX-2發揮對心臟的保護作用[33]。

KEGG通路分析表明，PI3K-Akt信號通路具有最高的度值，可能是治療機制中的重要通路。在生理刺激下，Akt的活化促進細胞的肥大[34]。據報道，PI3K/Akt活化可刺激MAPKs的磷酸化，在各種應激下誘導細胞內的各種基因轉錄，如誘導心肌細胞的炎癥[35]。因此，PI3K/Akt是心臟肥大過程中的一個重要信號通路[36]。由于生理性肥大引起的短期AKT活化可能對心臟具有保護作用，但長期會造成病理性心臟肥大和心肌鈣化，最終導致心力衰竭[37]。所以，阻斷PI3K/Akt信號通路可能對緩解心臟肥大進展和壓力超負荷引起的功能改變起到關鍵作用, 對慢性心力衰竭的防治具有重要意義[38]。

在通路分析中，除了PI3K-Akt信號通路之外，PPAR 信號通路也具有較高的度值，發揮著治療慢性心力衰竭的重要作用。作為核激素受體超家族中的配體激活轉錄因子，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)由PPARα、PPARγ 和PPARβ/δ 組成[39]。PPAR 根據其組織分布不同而具有不同的生理功能[40]。其3種亞型都在心肌細胞中表達，并且與脂質代謝和能量平衡的調節以及心臟方面密切相關[41]。然而，PPARα/γ 激動劑有較多不良反應而未能應用于臨床[42]。在自發性高血壓大鼠模型的研究中，中醫藥能夠改善線粒體超微結構損傷，恢復PPARα和PPARγ 表達水平，發揮對自發性高血壓大鼠心臟重塑和功能障礙的保護作用[43]。可見，PPAR是中醫藥治療慢性心力衰竭的潛在治療靶標，在藥物開發中應該充分發揮中醫藥優勢，開發出更安全、更有效的PPAR激動劑。

多項研究表明，網絡藥理學研究可以闡明中藥“多成分-多靶標”的作用特點。本研究經過網絡藥理學分析預測發現，真武湯主要通過活性化合物(山奈酚)的靶標(PTGS2等)調節機制和PI3K-Akt、PPAR 等信號通路，發揮治療慢性心力衰竭的作用，不僅為本課題的研究提供了新的方向，也為其他方劑的研究提供參考。