益腎止血顆粒對IgA腎病模型大鼠的影響?

鄒 迪，張守琳△，王銀萍，王宏安，劉艷華，崔成姬，張洪寶，金 迪

(1. 長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021； 2. 長春中醫藥大學，長春 130117)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)為病理學診斷名稱，臨床表現為發作性肉眼血尿伴持續性鏡下血尿，可伴有蛋白尿、高血壓、腎功能損害。IgA腎病是國內最常見的原發性腎小球疾病，發病率占原發性腎小球病的58.2%[1-2],且逐年升高。IgA腎病患者中15%～40%在確診后10～20年逐漸進展至終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)[3]，需要透析或腎移植。目前西醫治療本病，糖皮質激素和免疫抑制劑的有效性及安全性仍存在爭議，故不能被廣泛應用；對于單純以血尿為主，尿中無蛋白或24 h尿蛋白定量<1 g的IgA腎病只能動態觀察，且這部分患者20年后仍可發展為ESRD。應用ACEI或ARB雖然可以在一定程度上減輕蛋白尿，但在IgA腎病的治療中療效欠佳[4-5]。

益腎止血顆粒是長春中醫藥大學附屬醫院腎病科主任張守琳的經驗方，功效為滋陰補腎、健脾利濕、活血化瘀。自1996年應用其治療IgA腎病20余年，可有效減輕患者血尿、蛋白尿及臨床癥狀[6]。因此，本實驗擬采用經典的IgA腎病大鼠模型，考察該方對IgA腎病的療效及可能的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性SD大鼠共90只，6～8周齡，體質量(180±20) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006，實驗動物編號20180059。常規飼養于長春中醫藥大學SPF級動物房，大鼠普通飲食，自由飲水(由實驗室提供)，室溫(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，自然晝夜節律光照。本實驗經長春中醫藥大學倫理委員會批準。

1.2 藥物及制備

腎炎康復片(國藥準字Z10940034)，天津同仁堂集團股份有限公司。益腎止血顆粒組成：黃芪、枸杞子、女貞子、地黃、墨旱蓮、大薊、小薊、大黃、梔子、白茅根、槐花、益母草、牡丹皮、赤芍、當歸等，批號20180510，由長春中醫藥大學中醫藥研究中心提供。

1.3 主要儀器及試劑

正置研究級顯微鏡(Olympus，型號BX53)；組織破碎機(上海般諾生物科技有限公司，型號BIO-950)；分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司，型號721G)；全自動生化分析儀(東莞市健威醫療器械有限公司，型號BS-380)；熒光素標記兔抗鼠IgA抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-10491R，規格100ul)；全自動尿沉渣分析儀(Sysmex，型號UF-1000i)；IL-1、IL-6、IL-10、MMP-9、TIMP-1酶聯免疫吸附測定試劑盒(美國R&D公司，批號分別是RRA00、R6000B、R1000、RMP900、RTM100)；牛血清白蛋白、脂多糖、蓖麻油(美國sigma公司，批號分別為A1933、SMB00610、259853)；四氯化碳(北京化學試劑廠，批號C112040)。

2 方法

2.1 分組及造模

對90只SD大鼠采用分層隨機的方法分為空白組、模型組、益腎止血顆粒高劑量組、益腎止血顆粒中劑量組、益腎止血顆粒低劑量組、腎炎康復片組(對照組)每組各15只。參照陸慧渝[7]等方法制作IgA腎病大鼠模型，給予BSA配成100 g/L濃度的稀釋液體，以4 ml/kg灌胃隔日1次，共持續8周；將CCl4與蓖麻油以1∶3的比例混合均勻，0.4 ml/只皮下注射，每周1次，共持續8周；將LPS配成0.25 g/L的溶液，于第6周每只尾靜脈注射0.2 ml。于造模結束后每組大鼠各選擇3只，取腎臟行免疫熒光檢查驗證模型。

2.2 給藥

于第9周開始給藥：對照組給予腎炎康復片0.648 g·kg-1·d灌胃，空白組、模型組給予生理鹽水2 ml·kg-1·d灌胃，益腎止血顆粒組應用益腎止血顆粒分別灌胃，即低劑量組1.406 g·kg-1·d，中劑量組2.813 g·kg-1·d，高劑量組5.625 g·kg-1·d，每組大鼠給予相應藥物灌胃，每日1次，連續8周，于第16周末取材。

2.3 取材與指標檢測

2.3.1 大鼠一般情況 觀察各組大鼠毛色、光澤度、活動次數、精神狀態、食欲、大便、體質量及尿顏色改變等。

2.3.2 各時相尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量檢測 分別將大鼠放入大鼠代謝籠中,收集24 h尿液(此期間禁食不禁水)，采用尿沉渣計數法檢測尿紅細胞個數，采用磺基柳酸法檢測24 h尿蛋白定量。

2.3.3 腎功能與血清細胞因子水平檢測 實驗結束時，用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，從腹主動脈采血并分離血清備檢。應用全自動生化分析儀檢測血清BUN、SCr的含量，采用酶聯免疫法檢測血清IL-1、IL-6及IL-10 含量。

2.3.4 腎組織MMP-9、TIMP-1含量檢測 取腎臟后清理血液及筋膜，將腎臟縱行剖開切取皮質部組織，用研磨機研磨均漿，漿液采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測腎組織中MMP-9、TIMP-1含量，打印檢測結果分組統計。

2.3.5 腎組織IgA免疫熒光檢測 剪取雙側腎臟稱重，左側固定做病理用，直接法染色。新鮮組織冰凍切片(8 μm)、干燥、冷丙酮固定40 min,PBS液洗后滴加熒光素標記的兔抗大鼠IgA抗體,溫度37 ℃烘箱中孵育40 min,PBS液洗后用緩沖液甘油封片,正置研究級顯微鏡(Olympus)熒光模式下觀察。以鏡下無熒光顯示為(-)，極弱黃綠色熒光顯示為(±),有黃綠色熒光顯示為(+)，較強的黃綠色熒光顯示為(++),強、略刺眼的黃綠色顆粒狀熒光顯示為(+++)，強、略刺眼的黃綠色團塊狀熒光為(++++)。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 益腎止血顆粒對IgA腎病大鼠一般情況的影響

造模過程中共死亡7只大鼠，造模后每組選取3只大鼠用于驗證模型是否成功。空白組大鼠狀態始終良好，體質量逐漸增加。造模組大鼠4周后出現食欲減退，毛色晦暗，活動減少，體質量減輕，尿色變深，8周癥狀加重。給藥后腎炎康復片組及益腎止血顆粒組大鼠食欲、活動明顯好轉，體質量增加。

表1顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質量減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。自第10周起與模型組比較，各治療組大鼠體質量增加，差異有統計學意義(P<0.05)。

3.2 益腎止血顆粒對IgA腎病大鼠血尿、蛋白尿的影響

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠10周、12周、16周尿紅細胞、24 h尿蛋白定量增多(P<0.05)；與模型組比較，腎炎康復片組與益腎止血顆粒組從10周起(即給藥2周)尿紅細胞、24 h尿蛋白定量均明顯減少，隨給藥時間延長，尿紅細胞、24 h尿蛋白定量減少更為明顯(P<0.05)，其中益腎止血顆粒中劑量組效果最好。

3.3 益腎止血顆粒對IgA腎病大鼠血清腎功及細胞因子的影響

表3示，與空白組比較，模型組大鼠血SCr、BUN、IL-1、IL-6、IL-10升高(P<0.05)；與模型組比較，腎炎康復片組及益腎止血顆粒組大鼠血SCr、BUN、IL-1、IL-6、IL-10下降(P<0.05)。

3.4 益腎止血顆粒對IgA腎病大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的影響

表4示，與空白組比較，模型組腎組織中MMP-9含量明顯下降，TIMP-1含量明顯升高，MMP-9/TIMP-1下降(P<0.05)；與模型組比較，腎炎康復片組及益腎止血顆粒組MMP-9升高，TIMP-1降低，MMP-9/TIMP-1上調(P<0.05)。

注：空白組(×400)模型組(×400)模型組(×400)圖1 造模后大鼠空白組及模型組腎臟病理免疫熒光比較

3.5 益腎止血顆粒對IgA腎病大鼠腎臟病理免疫熒光的影響

空白組腎皮質內腎小球未見IgA免疫熒光染色，與空白組比較，模型組腎小球內可見大量熒光信號，熒光較強且呈不連續顆粒狀沉積(見圖1)。按國際共識對IgA腎病的診斷標準，表明動物模型復制成功。

表5顯示，正常組大鼠腎系膜區無IgA沉積，模型組腎小球系膜區有較強的團塊狀黃綠色強IgA熒光或顆粒狀中等強度IgA熒光。益腎止血顆粒高、中、低劑量組及腎炎康復片組大鼠腎小球系膜區顯示為散在的線狀或顆粒狀輕度IgA熒光或中等強度IgA熒光，較模型組明顯減弱。

表5 各組大鼠給藥后腎小球IgA免疫熒光半定量評分(頻數)

4 討論

IgA腎病為免疫病理診斷，其特點為腎小球系膜增生，用免疫熒光法檢查見腎小球系膜區有IgA沉積。血尿、蛋白尿為IgA腎病最常見的臨床表現，常表現為發作性肉眼血尿伴持續性鏡下血尿，可伴有輕度蛋白尿或大量蛋白尿。現代研究認為，在IgA腎病發病過程中,多種原因共同作用[8-10]，尤其是細胞外基質的過度沉積，導致免疫應答異常、腎小球硬化和腎間質纖維化，從而引發腎衰竭或加重發展。

細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)積聚過多是引起IgA腎病進展的機制之一。ECM的生成和降解維持動態的平衡，在這個過程中,基質蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)可降解ECM，金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)可抑制MMPs，其中MMP-9能降解ECM膠原和非膠原成分，同時TIMP-1可抑制MMP-9，從而影響ECM的積聚。大量實驗證明，IgA腎病的發生發展與基質金屬蛋白酶-9異常相關，通常與尿蛋白呈正相關, 與血肌酐呈負相關[11]。因此，MMP-9/ TIMP-1失衡是導致ECM降解異常的重要環節。研究表明，通過調節腎臟組織MMP-9/TIMP-1，可改善腎纖維化的病變程度，延緩IgA腎病進展[12-14]。同時，白介素作為具有生物活性的炎性因子，與IgA腎病密切相關，可激活并調節免疫細胞，引起免疫應答異常及免疫炎癥反應，并可促進系膜基質增多從而引發IgA腎病。

本課題組基于中醫理論提出IgA腎病本虛標實、脾腎虧虛是其本，濕熱瘀阻是其標。益腎止血顆粒功效為滋陰補腎、健脾利濕、活血化瘀，是根據多年臨床經驗研制而成，可顯著降低IgA腎病血尿、蛋白尿。益腎止血顆粒方中君藥為黃芪、枸杞子，黃芪補益中氣，升陽固表，利水消腫；枸杞子補肝腎、益精血，兩藥合用既能補腎健脾、滋養腎精，同時又能利尿祛濕。現代藥理研究認為，黃芪能促進受損傷腎組織修復而具有降低蛋白尿、保護腎功能的作用。熱聚膀胱、熱傷血絡發為尿血，耗傷腎陰，故以女貞子、生地黃、旱蓮草助君藥補腎養陰以培其本，二薊清熱止血散瘀以治其標，共為臣藥。大黃瀉火解毒，梔子清熱利濕，配合槐花涼血止血，則熱清而血自止；白茅根清熱、涼血、止血、利尿；益母草活血調經，利水消腫；牡丹皮、赤芍清熱涼血散瘀，使止血而不留瘀；當歸和血可防諸藥寒涼太過，上8味共為佐使藥，諸藥合用有滋陰補腎、健脾利濕、活血化瘀之效。

本實驗顯示，與空白組比較，模型組大鼠UTP、尿RBC及血清SCr、BUN明顯升高；與模型組比較，經治療后益腎止血顆粒各組及腎炎康復片組大鼠UTP、尿RBC、SCr、BUN均降低，說明益腎止血顆粒能明顯減輕IgA腎病模型大鼠尿紅細胞及尿蛋白，保護腎功能。同時與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10明顯增高，腎組織MMP-9降低，TIMP-1升高，MMP-9/TIMP-1呈失衡狀態；與模型組比較，經治療后益腎止血顆粒各組及腎炎康復片組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10下降；腎組織MMP-9升高，TIMP-1降低，MMP-9/TIMP-1比例升高，MMP-9/ TIMP-1失衡糾正，揭示了益腎止血顆粒可能通過調節IL-1、IL-6、IL-10水平及MMP-9、TIMP-1的表達及MMP-9/TIMP-1，從而通過調節免疫反應及改善ECM的過度積聚起到治療作用。