侵襲性念珠菌病耐藥機制的研究進展

張伶玲 綜述，劉泉波 審校

(重慶醫科大學附屬兒童醫院感染科/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地/兒童感染免疫重慶市重點實驗室，重慶 400014)

真菌感染，尤其是念珠菌感染正在以驚人的速度迅速上漲。據估計，全球有超過500萬種真菌，約有300種真菌可引起人類疾病[1]。侵襲性念珠菌病(IC)是住院患者最多見的真菌感染疾病。最新的全球報告估計，每年有75萬多例IC病例，導致超過5萬例死亡[2]。近些年，念珠菌感染的流行病學不斷發生變化，非白色念珠菌感染逐漸增多，占許多地區IC的50%以上。我國一項對河北地區15家三級教學醫院的研究表明，IC中非白色念珠菌檢出比例已超過白色念珠菌，分別為58.21%和41.79%[3]，這與中國侵襲性真菌檢測網(CHIF-NET)2010—2014年多中心侵襲性酵母菌感染的臨床研究結果相似[4]。由于目前治療侵襲性真菌感染疾病的藥物種類少，耐多藥念珠菌越來越多地被報道，這嚴重影響著人類健康。因此了解念珠菌的耐藥現狀及真正理解藥物耐藥性產生的分子機制對減少耐藥性的發生至關重要。

1 念珠菌的耐藥現狀

與治療細菌感染的抗生素類似，念珠菌屬對抗真菌藥物的耐藥性嚴重威脅著公眾健康。根據美國疾病控制和預防中心(CDC)2019年《抗生素耐藥性威脅報告》，每年有超過34 000例病例，其中1 700例死于耐藥念珠菌。丹麥的一項調查結果表明常見的念珠菌中，白色念珠菌對唑類藥物的耐藥率僅為0.4%，在近平滑念珠菌和熱帶念珠菌中接近6.0%，光滑念珠菌更是達到了9.1%[5]。而全球SENTRY監測項目指出，熱帶念珠菌對氟康唑這單一藥物就達到了11.6%的耐藥率，與光滑念珠菌的11.9%接近[6]。棘白菌素類藥物的耐藥性也不可小覷，美國一家醫院的研究表明，10年時間光滑念珠菌對該藥物的耐藥率從4.9%上升至12.3%[7]，這遠高于SENTRY報道的0～2.8%[6]。我國念珠菌耐藥問題也越來越引人關注。CHIF-NET對國內多家醫院的調查研究指出，2010—2014年白色念珠菌對唑類藥物耐藥率不足1.0%，而光滑念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為19.0%和18.7%，熱帶念珠菌對2種藥物的耐藥率均達到了20.0%以上[8]?？梢?，無論國內還是國外，念珠菌耐藥問題都較為嚴重，尤其是非白色念珠菌。

2 對唑類藥物的耐藥機制

2.1ERG11基因突變和過度表達 唑類藥物的靶酶14-α脫甲基酶(ERG11p)，是麥角甾醇生物合成途徑的關鍵酶。ERG11基因突變改變了ERG11p分子結構，使唑類藥物無法與靶酶有效結合而發生耐藥。已經證明ERG11的點突變，特別是發生在105～165、266～287和405～488氨基酸之間的3個“熱點”區域，可以降低念珠菌對唑類藥物的敏感性[9]。值得注意的是，突變位點的差異對不同唑類藥物影響不同[10-11]。例如，釀酒酵母菌中Y140F/H的改變會顯著降低短鏈唑類藥物(氟康唑和伏立康唑)的活性，但不會影響長鏈唑類藥物(伊曲康唑和泊沙康唑)的活性[11]。ERG11基因過度表達使14-α脫甲基酶增多，唑類藥物不能與過多的靶酶結合，從而引起耐藥性的產生。這一點在JIANG等[12]對熱帶念珠菌的研究中得以證明。但是關于ERG11基因的改變對不同念珠菌耐藥性產生的影響仍需要更進一步的研究。

2.2藥物外排泵的過度表達 藥物外排泵是一種將細胞內藥物轉運到細胞外的特殊蛋白泵。外排泵編碼基因的過度表達使跨膜轉運蛋白增多，減少了胞內藥物濃度而產生耐藥。與念珠菌耐藥相關的外排泵轉運蛋白有2種，一種是利用三磷酸腺苷(ATP)水解作為能量來源的ABC轉運蛋白家族，另一種是利用膜電位驅動外排的主要易化擴散載體家族。ABC轉運蛋白Cdr1和Cdr2的過度表達常與白色念珠菌耐藥有關，尤其是接受長期抗真菌治療的患者[13]。除Cdr1和Cdr2外，Snq2轉運蛋白在光滑念珠菌耐藥性的產生中也起著重要作用[14]。與Cdr1和Cdr2同源的CkABC1和CkABC2也參與了克柔絲念珠菌對唑類藥物耐藥。GOHAR等[15]研究結果表明，ABC轉運蛋白家族介導的藥物外排，尤其是CgSnq2和CgCdr1在光滑念珠菌對氟康唑耐藥性的產生中具有重要意義。屬于主要易化擴散載體家族的轉運蛋白Mdr1，參與了白色念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對唑類藥物的耐藥，克柔絲念珠菌中還沒有探索到耐藥相關的轉運蛋白[16]。DHA1亞家族轉運蛋白CgAqr1、CgQdr2、CgTpo1和CgTpo3也與光滑念珠菌耐藥有關[17]。因此，無論根據涉及耐藥相關基因的數量或是臨床耐藥菌株中觀察到的過度表達頻率，ABC轉運蛋白家族相關基因過度表達可能是念珠菌屬耐藥的主要機制。

2.3鋅族轉錄因子突變 與念珠菌屬耐藥相關的鋅族轉錄因子主要是UPC2、TAC1、MRR1及PDR1。UPC2調控ERG11基因的表達，其功能獲得性(GOF)突變的發生會改變ERG11基因的轉錄水平，導致基因的過度表達及對藥物的敏感性降低[18]。Cdr1及Cdr2表達量的多少與TAC1有關，研究證明，Cdr1可能是TAC1介導唑類藥物耐藥的主要原因[19]。而Mdr1基因的表達水平受到MRR1的調控，其GOF突變使靶基因的表達發生改變而參與耐藥發生。已經證明Mdr1在氟康唑和伏立康唑耐藥中起作用，盡管其對其他唑類抗真菌藥物如伊曲康唑和泊沙康唑的最低抑菌濃度值變化不大[10]。存在于光滑念珠菌中的PDR1主要參與ABC轉運蛋白基因CgCdr1、CgCdr2和CgSnq2的調節，CgPDR1的點突變會增加CgCdr1和CgCdr2的表達，與臨床分離株對唑類藥物的耐藥息息相關[20]。

2.4改變代謝途徑 麥角甾醇生物合成由25種不同的酶級聯催化，合成途徑中其他成分的改變如Δ-5,6-去飽和酶Erg3功能的喪失，也參與念珠菌對唑類藥物的耐藥。ERG3基因的失活使代謝通路發生改變，減少了毒性中間產物的產生，引起對不同唑類藥物的相互耐藥[21]。雖然該耐藥機制較為罕見，但在臨床菌株中已經觀察到此現象。ERG相關基因的表達受到Upc2和Ndt80的調控。當破壞Upc2或Ndt80時，ERG11、ERG25、ERG6、ERG2、ERG3及ERG4的表達顯著降低，并可以恢復對唑類藥物的敏感性。與Upc2相比，Ndt80在近平滑念珠菌耐藥性的產生中發揮的作用更強[22]。

2.5線粒體活性的改變 早期研究有報道線粒體缺陷引起的唑類藥物耐藥，這可能是減少了線粒體中ATP的產生和活性氧的種類[23]。CYTb基因編碼線粒體氧化呼吸鏈中的細胞色素b，主要參與念珠菌屬體內的氧化還原反應。FAN等[24]在對熱帶念珠菌耐藥機制的研究中表明，唑類藥物耐藥組菌株CYTb基因的表達水平明顯低于唑類藥物敏感組菌株，提示CYTb基因表達水平的降低可能與熱帶念珠菌對唑類藥物耐藥具有一定的相關性。但先前JIANG 等[12]研究結果指出，唑類藥物敏感組與耐藥組CYTb基因的表達水平無明顯差別，這表明線粒體活性的改變與唑類藥物耐藥相關性不大。因此，需要更多的研究證實兩者間的關系。

3 對棘白菌素類的耐藥機制

棘白菌素類藥物以β-1,3-D-葡聚糖合酶為靶點，通過阻斷葡聚糖的合成、破壞細胞壁結構的完整性，最終使細胞裂解死亡發揮抗真菌作用。其耐藥性產生的主要機制是編碼葡聚糖合酶催化亞基的基因(FKS1和FKS2)發生點突變，導致氨基酸的替換及由此產生的葡聚糖合酶結構的改變，從而降低了棘白菌素對葡聚糖合酶的敏感性[9,21]。其中FKS1點突變主要包括S629P、F625Δ和F625C，FKS2點突變主要包括F659Δ、S663F、R1378S、R1378G、S663P、P667H、P667T、E655G和E655K[25-26]，這一點在白色念珠菌及部分非白色念珠菌中均得以證實。適應性應激反應的啟動也是棘白菌素耐藥的潛在機制。體外研究表明，當棘白菌素類藥物抑制葡聚糖合成時，念珠菌屬會增加細胞壁其他成分如幾丁質的合成，這種增加是由高滲透壓甘油(HOG)途徑、PKC-MAPK途徑和鈣調神經磷酸酶信號通路引起的[27]。Hsp90能夠調節鈣調神經磷酸酶和許多應激激活蛋白激酶的功能，抑制Hsp90可降低發生FKS1突變的臨床分離株對棘白菌素的耐藥性[28]。另外基因組可塑性也與棘白菌素耐藥有關，這種可塑性可能會導致雜合子丟失、染色體拷貝數增加、非整倍體的形成等，但其背后的具體機制還需要進一步研究。

4 對多烯類的耐藥機制

多烯類藥物以細胞膜中的麥角甾醇為靶點，與甾醇相互作用導致細胞膜產生孔隙，從而使細胞內單價離子(如K+、Na+、H+和Cl-)快速外漏引起細胞崩解死亡。近幾年，有研究強調多烯類藥物可以直接結合并從細胞膜中提取麥角甾醇，阻止麥角固醇發揮其重要功能[29]。另外，多烯類藥物還可以引起真菌細胞內活性氧的積累，誘導細胞凋亡[30]。多烯類藥物的耐藥性相對罕見，其耐藥性產生的主要原因是細胞膜麥角固醇含量的降低或結構的改變，這可能與先前使用三唑類藥物降低了膜麥角固醇的濃度或編碼麥角固醇生物合成途徑的相關基因(如ERG3、ERG6、ERG24和ERG2等)發生突變有關[31]。ERG3基因的錯義突變還可以引起唑類藥物與兩性霉素B交叉耐藥，這一點在熱帶念珠菌中已經得到證實。

5 對氟胞嘧啶的耐藥機制

5-氟胞嘧啶可抑制真菌細胞核酸合成作用。其在胞嘧啶通透酶(由FCY2基因編碼)的協助下主動轉運到真菌細胞中，隨后經胞嘧啶脫氨酶(由FCY1基因編碼)轉變為5-氟尿嘧啶。后者經尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(由FUR1基因編碼)生成5-氟尿嘧啶單磷酸鹽，通過抑制轉錄、DNA復制和蛋白質的合成發揮抗真菌作用。雖然氟胞嘧啶對大多數念珠菌具有很好的活性，但是此類藥物在單藥治療期間容易產生耐藥，限制了其在臨床中的使用，因此主要與多烯類化合物聯合應用治療隱球菌性腦膜炎[1]。文獻報道，念珠菌對氟胞嘧啶的耐藥性與FCY1、FUR1、FCY2 基因突變有關[32-33],其中以FUR1基因突變最為常見。FUR1基因突變降低了5-氟胞嘧啶轉化為具有細胞毒性代謝產物的能力，導致了耐藥性的發生。

6 解決真菌耐藥的策略

由于抗真菌藥物種類有限，臨床醫生必須合理使用現有抗真菌藥物，避免過早出現耐藥。這需要臨床醫生掌握常用抗真菌藥物特定的抗菌譜及藥物在體內不同組織部位的濃度，由此選擇合適的藥物種類及劑量。了解所在地區及醫院真菌的流行病學及耐藥現狀也具有重要指導意義。而積極尋找新的藥物靶點、研發新型抗真菌藥物也勢在必行。一方面可以對原有的抗真菌藥物進行化學修飾以提高其抗菌活性，另一方面可以開發新型結構的藥物或尋找新的作用靶點。目前，已經研發的麥角甾醇生物合成抑制劑包括VT1129、VT1598和VT1161，它們高選擇性地作用于真菌酶CYP51，而對人體細胞內相關酶沒有抑制作用，顯著降低了藥物的毒性作用[34]。針對葡聚糖合酶這一靶點，已報道的包括具有代表性的長效棘白菌素類藥物 CD101與三萜糖苷化合物SCY-078，后者是一種新型的口服抗真菌藥物，填補了棘白菌素類藥物只能靜脈給藥的空白[35-36]。作用于其他新靶點的藥物也不斷被挖掘，比如作用于真菌線粒體膜破壞氧化呼吸鏈的芳香酰胺類抗真菌藥物T-2307[37]、抑制肌醇酰基轉移酶破壞糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白合成的E1210[38]，以及選擇性抑制嘧啶生物合成途徑關鍵酶二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)活性的F901318[39]，但這些藥物大部分尚處于臨床試驗階段，還需要進一步驗證其安全性及臨床可行性。另有研究表明，乙醛酸循環中的異檸檬酸裂合酶是真菌產生毒力所必需的，通過抑制該酶的活性可對不同真菌具有抑制作用，這為開辟新型抗真菌藥物提供了思路[40]。此外，從中藥成分中尋找有效抗真菌藥物或增效劑也是一重要手段。堅信不久將涌現出更多值得深入研究的新型抗真菌藥物，為臨床治療真菌感染提供更多可供選擇的治療方案。

7 小 結

綜上所述，真菌耐藥情況日趨嚴重，盡管抗真菌藥物不斷發展，但新型藥物難以較快應用于臨床。加上侵襲性念珠菌病抗感染療程長，治療過程中有可能使藥物敏感性降低甚至產生耐藥性，使得臨床治療失敗。因此，在臨床工作中應及早進行藥敏試驗并根據結果調整藥物，最大限度地減少耐藥菌株的產生。同時應加強對患者的管理及藥物的監測以優化治療效果和減少不良反應的產生。另外，應加強對念珠菌耐藥機制深入了解，以提高現有抗真菌藥物的療效，積極尋找新的藥物靶點以抑制耐藥率的上升。