自由基在白血病干細胞衰老進程中的作用研究進展

李 淵 綜述，顧守美，張素琴，王燏芳，畢玉洮，郭太兵，周 玥 審校

(1.大理護理職業學院，云南 大理 671006；2.大理大學第一附屬醫院呼吸內科，云南 大理 671000；3.大理大學組織胚胎學教研室/云南省細胞生物學重點實驗室，云南 大理 671000)

白血病是血液系統的惡性腫瘤。白血病患者體內有大量的白血病細胞，這些具有極強克隆性的細胞浸入人體的骨髓和各個組織器官中大量增殖，抑制骨髓的正常造血，破壞組織和器官的功能。白血病是一種非常復雜的疾病，包括分子生物學發病機制及病因、多樣性的臨床癥狀、因人而異的個體化表現及病癥、需不斷調整和更新的治療方案、難以預測的臨床預后及復發風險等，都體現其復雜性。白血病細胞中存在的白血病干細胞(LSCs)是白血病發生、發展、復發、耐藥的根本原因。在生物界中，衰老是物種的普遍規律，細胞作為生命個體最基本的結構和功能單位，在不斷地進行新生、衰老和死亡，LSCs也擺脫不了衰老的命運[1]。人為地促進和誘導腫瘤細胞的衰老是治療腫瘤的新觀點[2]。在衰老的機制中，有自由基學說、遺傳學說、免疫學說等，本文從自由基學說的角度綜述LSCs的衰老，進而探究白血病的發生、發展。

1 LSCs生物學特性

對于LSCs的來源問題，目前沒有完全統一的結論。有研究已證實，LSCs可能來源于以下4種途徑：正常的造血干細胞、血液血管干細胞、已分化完成的造血祖細胞、基本成熟的白血病細胞[3-4]。急性髓系白血病中的LSCs均由正常的造血干細胞轉化而來，其形成的結果是導致機體發生病態造血，從而造成一系列的貧血、感染、出血等惡性血液病癥狀。LSCs可能來源于已分化完成的造血祖細胞，融合基因MLL-AF9能夠促進重置造血祖細胞的基因組，從而可能重新自我更新成為LSCs[5]。這類LSCs與正常的造血干細胞特性完全不同，其具有明顯的腫瘤細胞特性，進而破壞正常造血功能促進白血病的發生[6]。LSCs也可能來源于血液血管干細胞和基本成熟的白血病細胞，這類LSCs的產生機制目前還不是很明確，需進一步證實。

與正常的造血干細胞比較，LSCs存在多種生物學特性，如獨特的生存優勢、更強的自我更新機制、特異的免疫表型、復雜的多重耐藥機制特性等。LSCs可自主進入細胞周期，通過無限增殖和抗細胞凋亡以獲得獨特的生存優勢和更強的自我更新機制；CD34、CD38、CD123、CD117、CD71、CD44、HLA-DR、TIM3、CLL-1、CD96、CD47、CD32和CD25等表面分子標志物，是LSCs特異的免疫表型；LSCs總是處在細胞周期之外的靜止期，躲避化療藥物的殺傷，從而形成耐藥性。LSCs有多種調控異常途徑,目前發現與LSCs相關的信號通路包括WNT/β-catenin、PCGF4、JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS、NF-κB、Notch等，因此從這些信號通路和基因入手，進行相應的靶向研究，可能會引發出新的臨床治療思路[7-9]。

2 LSCs衰老

衰老自概念形成以來就備受人們的關注，研究熱度較高。就目前人們熟知的所有生物，衰老的基本過程是大體一致的。衰老是一個綜合的、復雜的過程，其發生與機體的結構和功能退化相伴隨[10]，其中就人類整體而言，普遍性、進行性、退化性和內因性是衰老的基本特征。隨著生理、生化方面的理論不斷革新，關于衰老機制也得到了更深層次的補充和完善。眾多的衰老機制中，自由基學說一直被人們普遍關注和接受。

細胞衰老是指細胞在生命的進程中,隨著機體的不斷老化而出現的功能紊亂和分化增殖能力下降的過程。如此，LSCs的衰老也是一種漸進性的、伴發形態學改變的、不可逆性的退行性過程[11]。細胞衰老與細胞的形態改變相伴隨，絕大部分衰老的細胞會出現細胞膜的通透性和流動性降低，染色質會逐漸呈現凝聚、固縮、碎裂、溶解的不可逆性過程，線粒體數量減少且功能退化，高爾基體形態消失，細胞核染色加深且形態增大，細胞質內脂類含量增多。衰老的細胞分子水平也發生變化：DNA的復制與轉錄在細胞衰老時均受抑制；RNA中mRNA和tRNA含量均降低；蛋白質的合成量、穩定性、抗原性、可消化性均下降；酶分子的二級結構、溶解度、等電點發生變化；不飽和脂肪酸被氧化，生物膜流動性下降。

3 自由基

自由基又稱游離基,是指化合物的共價鍵發生龜裂而形成的未配對電子的原子或原子團。自由基是機體氧化反應過程中產生的中間代謝產物，具有高能的化學活性。人體內的自由基種類有很多，用來說明衰老發生機制的自由基主要是超氧陰離子自由基 (O2-)、羥自由基(·OH-)和類脂質過氧化氫自由基(H2O2)。它們具有強氧化的功能，存在于機體的各類生理和病理進程中，在機體的衰老進程中也發揮著重要作用。機體內的自由基不僅可以自我產生，也可以來源于外界。自由基對機體的作用是雙重的，過多的自由基可使正常細胞結構和功能受損，甚至導致細胞死亡，完全清除自由基也會對機體造成損傷，少量的自由基可以發揮其殺滅微生物和促進基因突變適應環境的作用，平衡機體內氧化和抗氧化之間的關系。

4 自由基與LSCs衰老的關系

自由基含量的高低，直接影響了腫瘤干細胞的凋亡、分化、增殖與衰老。自由基含量增高，可抑制LSCs自我更新的生物學特性，進而抑制其增殖，且促進其分化、誘導其衰老及凋亡，導致LSCs減少；與已完全分化的白血病細胞相比，LSCs中的自由基含量更低，低含量的自由基對于維持LSCs的存活和特性尤為重要,自由基含量過高，極有可能誘發LSCs發生衰老，甚至死亡[12]。有研究證實：當歸多糖可以調控CML骨髓間充質干細胞衰老，從而抑制LSCs的增殖，其可能的機制是提高細胞的抗氧化能力和降低細胞氧化損傷[13]。

4.1自由基引發端粒縮短 端粒的主要功能是維持機體染色體的完整性。細胞周期性的復制會引發端粒進行性縮短，端粒長度低于最低限度時，染色體的穩定性便被破壞，細胞此時雖然繼續存活，但是已經不能進行正常的增殖分裂[14]。有研究已經表明，當歸多糖能可通過p16INK4a/pRb信號通路在白血病小鼠體內有效抑制LSCs端粒酶的活性，從而破壞端粒的穩定性，導致端粒縮短，降低LSCs的自我更新能力，促進LSCs的衰老[15]。也有研究證實，40 μg/mL的當歸多糖在體外作用CD34+CD38-LSCs 48 h后，細胞的端粒長度明顯縮短，端粒酶活性明顯下降，證實當歸多糖在體外可通過調控端粒系統來誘導LSCs的衰老[16]。端粒酶活性調控著端粒的長度，自由基的過度增多使得端粒的功能發生障礙，長度進行性地縮短，破壞了LSCs染色體的穩定性，LSCs雖然存活，但是增殖受到抑制，出現衰老和凋亡的征象。

4.2自由基損傷線粒體 細胞內的線粒體具有調控細胞凋亡的重要作用[17]。故細胞線粒體若想充分全面地發揮其功能，完整無受損是對線粒體的基本要求。有文獻報道，機體內的自由基大部分來源于線粒體，線粒體在產生能量的過程中可以釋放大量的自由基，如自由基不能被及時清除，會導致mtDNA突變，進而影響線粒體的功能，使得線粒體產能減少，細胞發生死亡，機體出現衰老的征象[18]。有研究顯示，POLG基因 (mtDNA 聚合酶γ)突變模型小鼠中，mtDNA 突變累積可導致模型小鼠出現衰老表型，同時小鼠的壽命大大縮短[19]。也有研究證實，mtDNA含量下降可致干細胞損耗,拓撲Ⅲα基因缺陷M1L系果蠅僅用短型(僅具有核定位信號，僅定位于細胞核)拓撲異構酶Ⅲα治療可恢復生存能力，但細胞mtDNA含量下降,ATP水平也降低,致M1L系雄性果蠅生殖系干細胞進行性損耗并引起不育;而用長型(在N端保留線粒體導入序列，在C端保留核定位序列，主要定位于線粒體，但在細胞核中有一小部分)拓撲異構酶Ⅲα治療則表型無明顯異常[20]。ABRAHAM等[21]的研究發現，SIRT1在LSCs線粒體的氧化磷酸化中起著重要作用，與SIRT1基因未敲除的慢性髓系白血病小鼠相比，基因敲除的小鼠白血病癥狀延緩，即抑制SIRT1基因的表達，可降低LSCs線粒體的功能和活性，導致氧化磷酸化作用減弱，誘發LSCs發生衰老。SINGH等[22]的研究發現，LSCs的生長依賴于氧化代謝，通過抑制急性髓系LSCs中的線粒體膜間組裝(MIA)途徑，延緩了急性髓系白血病的發生，抑制了LSCs的自我更新，降低了LSCs的生存能力，誘發LSCs發生衰老。

4.3自由基誘發生物膜損傷 當體內自由基不斷增多時，可引發膜上的脂類物質出現結構和功能的異常。生物膜由流動狀態逐漸轉化為剛性狀態，胞內的細胞器功能也受損。當生物膜被破壞時，細胞的功能也會隨之退化，誘發細胞衰老進程。ZHONG等[23]的研究發現，氧化固醇結合蛋白相關蛋白4L(ORP4L)是LSCs生存和生物能量所必需的蛋白，在正常的干細胞中不表達，但卻在LSCs中高度表達，ORP4L蛋白能夠從質膜中提取磷脂分子PIP2，并將其呈遞給磷脂酶PLCβ3，從而產生第二信使IP3和Ca2+依賴生物能，維持LSCs的生存和能量生成；LYZ-81蛋白與ORP4L存在競爭性作用，可抑制LSCs的能量生成，降低其生存能力，促進LSCs的衰老。

4.4自由基促進細胞凋亡 細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡過程。早期的研究發現，自由基過度增多可通過損傷DNA、影響信號傳導，以及參與p53、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)和Bax等凋亡基因表達調控等途徑介導細胞凋亡[24]。干細胞因擁有穩定的端粒酶，有效消除了端粒縮短的問題，而具有更強的自我更新特性；還可通過旁分泌效應，分泌血管內皮生長因子、白血病抑制因子(LIF)、SDF等趨化因子、Bcl-2基因等抑制凋亡因子，從而抑制干細胞發生凋亡。王東萍等[25]的研究發現，秦巴硒菇的提取物FA-2-b-β可通過增強Bax和Caspase-3的表達來抑制KG1a干細胞增殖，誘導其凋亡，其抗腫瘤效應是通過調控線粒體介導的凋亡途徑來實現的。周勇等[26]的研究發現，抗酗酒藥Disulfiram聯合銅通過上調腫瘤壞死因子-α表達誘導活性氧蓄積，促進LSCs凋亡。

4.5自由基造成DNA損傷 過量的自由基可使堿基完整性被破壞，誘發機體的染色體出現變異，基因出現突變。被損傷的基因片段不能及時被修復，導致基因中轉錄的mRNA減少，蛋白質表達減少，細胞功能減退，加速衰老的發生，導致機體出現肌肉萎縮、智力減退、記憶力障礙等衰老的表征。羅堉暄等[27]的研究證實，STAT3抑制劑Stattic可能通過誘導白血病細胞發生DNA損傷并阻礙其修復，進而促進細胞凋亡，加速LSCs的衰老進程。PODSZYWALOW-BARTNICKA等[28]的研究發現，可以通過抑制CML白血病小鼠模型中的RAD52基因表達，進而阻止CML的進程。有科研人員將RAD52蛋白敲除后，LSCs的DNA出現結合修復雙鏈斷裂而發生衰老死亡[29]。CIMMINO等[30]的研究發現，維生素C聯合PARP抑制劑可以使TET2突變的LSCs DNA發生去甲基化，降低其自我更新的特性，發生衰老和死亡。

5 小 結

以上研究證明，自由基與LSCs的衰老有著密切聯系。不斷深入探究LSCs衰老與自由基之間的關系，不僅有重要的理論意義，也有廣泛的發展前景。在機制研究方面，可以更加多元化認知LSCs的衰老機制，更深層次地理解衰老的過程，完善了LSCs衰老方面的知識框架，為開發出新型抗衰老、抗白血病發生的藥物提供了新思路和理論模型。在臨床治療方面，可以為白血病的預防、防治及預后開拓新的治療思路，有效降低白血病的發生率，延緩白血病的進展，減輕白血病患者的癥狀。綜上所述，通過控制自由基的含量，進而從基因分子水平來調控LSCs的凋亡和衰老，是未來治療白血病的一種新思路。自由基可以調控LSCs的衰老，但對于其他腫瘤及腫瘤干細胞是否也有調控作用尚不清楚。雖然現在關于LSCs衰老與自由基的關系這方面的機制和研究還不是很深入，但為后期研究白血病的發生機制及治療方案提供了有力的理論依據。