FTY720對腎缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用和機制#

李婷婷* 何冠軍 劉亞西 趙蕾 康道林 涂發平△

(1. 川北醫學院第二附屬醫院藥劑科，四川 南充 637100；2. 川北醫學院藥學院，四川 南充 637100；3.高坪區人民醫院腎內科，四川 南充 637100；4. 川北醫學院附屬醫院麻醉科，四川 南充 637000）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemiareperfusion injury，RIRI）是在腎移植、腎切除等復雜腎臟手中常見的病理生理過程，是引起急性腎損傷和腎功能衰竭的重要原因之一，此過程不僅導致腎臟本身缺血再灌注損傷，還會引起遠隔器官如肝、肺、腦等器官損傷[1-3]，其機制主要與再灌注過程中中性粒細胞的遷移、細胞因子的表達、氧化應激的增強、巨噬細胞的集聚等有關[4-5]。

術后腦損傷是外科手術后常見的一種中樞神經系統并發癥，主要表現為術后神經系統炎癥及其導致的認知功能障礙等，明顯影響患者術后恢復和生存質量[6]。芬戈莫德(Fingolimod，FTY720)是1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）類似物，通過激活SIP受體發揮獨特的免疫調節功能，是近年來備受關注的新型免疫調節劑[7-8]。FTY720作為S1P受體激動劑，與S1P受體結合能抑制巨噬細胞向腎移植、高血壓腎病、過敏性結膜炎、實驗性自身免疫性神經炎、腦缺血再灌注等動物模型的相應組織浸潤，減輕炎性反應[9-12]。FTY720除了作用于免疫系統外，還能穩定地穿過血腦屏障，直接作用于中樞神經系統內S1P受體而發揮多重生物學效應[13]。基于此，本研究擬通過建立大鼠RIRI模型來探討FTY720能否改善大鼠術后腦損傷及其機制，相關的研究國內外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠30只，體重 250~300g，由川北醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(川)2018-18，環境溫度21~25℃，自由進食、進水，采用隨機數字表法分3組（n=10）：假手術組（Sham）、模型組（RIRI組）和FTY720干預組（FTY720組）。

1.2 試劑與儀器

FTY720購自美國cayman公司，臨用時以生理鹽水配成濃度為1mg/ml注射液；Tunel試劑盒購自瑞士羅氏公司；兔源Caspase-3一抗1: 1000購自美國Abcam公司，β-actin一抗1: 1000購自美國Cell Signaling Technology公司，羊抗兔IgG二抗購自北京中杉公司，Morris水迷宮購自北京吉安得爾科技有限公司。

1.3 RIRI模型的制備及藥物注射方案

大鼠術前12h禁食，不禁水，以3%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，皮膚消毒，經背部雙側肋弓下緣距脊柱約0.5cm處行約長1.5cm的縱行切口，鈍性分離并暴露雙側腎臟，分離雙側腎蒂，切除右腎。Sham組僅暴露左側腎蒂，不阻斷；FTY720組和RIRI組大鼠采用無創動脈夾阻斷左側腎蒂，可見腎臟由鮮紅變紫黑色，表示夾閉成功，阻斷45min后去除動脈夾恢復腎血流。三組均以0.25%布比卡因分層浸入切口鎮痛，無菌絲線逐層縫合關腹，FTY720組于再灌注前15min通過腹腔注射FTY720（1 mg/kg），Sham組和RIRI組于再灌注前15min通過腹腔注射等體積生理鹽水。再灌注后經腹腔補充林格氏液（3mL/100g，每小時1次），操作過程中維持動物體溫在35.5℃~37℃。

1.4 標本采集

術后24h每組隨機選取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，斷頭取出腦組織和左側腎臟，左側腦組織和左側腎臟分別置4%多聚甲醛中固定，右側腦組織剝離海馬組織后置于液氮罐保存。

1.5 HE染色觀察大鼠腎臟和海馬組織CA1區病理形態

大鼠腎臟組織和海馬組織經浸洗、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片( 4 μm) 、脫蠟、復水、染色等步驟后，于光鏡下觀察腎臟和海馬組織CA1區的病理形態，評價其病理性損傷。

1.6 TUNEL法測定大鼠海馬組織CA1區神經細胞凋亡情況

海馬組織按1.5項方法石蠟包埋、切片( 4 μm) 、脫蠟、復水等步驟后，加入20 μg?mL-1不含DNase的蛋白酶K試劑，于20~37℃下反應15~30 min，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，加入TUNEL檢測試劑50 μL，于37℃避光孵育1 h；用PBS清洗3次，以封閉液封片后置于顯微鏡下觀察，記錄視野中TUNEL染色陽性細胞的數量。

1.7 Western blot檢測海馬組織Caspase-3表達水平

從液氮中取出各組海馬組織，稱量、研磨、裂解、離心、提上清，BCA試劑盒進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將不同分子量蛋白分離，并將目標蛋白轉移至PVDF膜上。caspase-3、β-actin一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，清洗后滴加ECL化學發光試劑，曝光獲取圖像，使用ImageJ軟件處理數據，結果以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值比值表示。

1.8 Morris水迷宮檢測大鼠認知功能

各組剩余大鼠于術后24h進行水迷宮實驗，參照文獻[14]。

實驗指標: (1)定位航行實驗，用于測試大鼠的學習能力：連續進行5 d，每天1次，分別從四個象限中點將大鼠面向池壁入水，記錄每只大鼠從入水到爬上平臺的時間，即為逃避潛伏期，若60 s后大鼠仍未找到平臺，以60 s計算，并將其引導至平臺停留10s。(2)空間探索實驗，用于測試大鼠的空間記憶能力：第6 d進行空間探索實驗，撤去平臺，選取和平臺對應的象限中點入水，記錄60 s內大鼠穿越平臺次數。

1.9 統計學方法

采用Spss17.0統計軟件進行實驗數據的分析，以均數±標準差（±SD）表示，兩組間比較采用最小差異法（LSD)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎臟組織的病理形態

光鏡下Sham組大鼠腎組織未見明顯病理改變，腎臟被膜完整，皮質和髓質分界清晰，其間可見少量炎細胞浸潤；RIRI組和FTY720組大鼠腎組織出現明顯病理改變，RIRI組腎臟皮質出現片狀壞死，形成紅色淡染的透明物質，皮質和髓質交界處腎小管和集合管灶狀壞死，結構不清晰，腎小管和集合管中可見均質紅染的蛋白樣物質沉積；FTY720組腎臟出現局灶性壞死，腎小管上皮細胞脫落，呈均質淡紅色物質，皮質和髓質交界處大量的腎小管和集合管萎縮、變性和壞死，結構不清晰，腎小管和集合管中可見粘液樣物質沉積；以上結果說明大鼠腎缺血再灌注損傷模型造模成功，見圖1。

2.2 海馬組織CA1區病理形態

光鏡下，Sham組海馬神經元結構完整，排列整齊；RIRI組海馬組織明顯水腫，椎體細胞數量減少，細胞變性壞死，FTY720組海馬病理變化較RIRI組明顯改善，病理學評分差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖2、圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織CA1病理評分比較（n=5）

2.3 TUNEL法測定海馬組織CA1區神經細胞的凋亡情況

Sham組偶見凋亡細胞，RIRI組可見較多TUNEL染色陽性，細胞核呈棕褐色的凋亡細胞；與 Sham 組比較，RIRI組大鼠大腦海馬組織CA1區凋亡細胞百分比明顯增加（P＜0.05）。與RIRI組比較，FTY720組凋亡細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠海馬組織CA1 TUNEL染色陽性細胞

圖5 各組大鼠海馬CA1區TUNEL陽性細胞數量比較（n=5）

2.4 Western blot 檢測海馬組織Caspase-3的表達水平

與 Sham組比較，RIRI組Caspase-3水平明顯增加（P＜0.05）；與RIRI組比較，FTY720組Caspase-3水平顯著降低（P＜0.05），如圖6、圖7所示。

圖6 各組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白的電泳圖

圖7 各組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白表達水平比較（n=5）

2.5 大鼠的認知功能

與Sham組相比，RIRI組大鼠逃逸潛伏期明顯延長，穿越平臺次數明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與RIRI組相比，FTY720組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數明顯增多，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠逃逸潛伏期、穿越平臺指數比較（±SD，n=5）

表1 各組大鼠逃逸潛伏期、穿越平臺指數比較（±SD，n=5）

注：aP＜0.05 vs Sham group；bP＜0.05 vs FTY720 group

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3 討論

隨著腎移植技術的不斷提高，腎移植術后患者存活率不斷提高，術后認知功能障礙正成為一個極其重要的臨床問題。FTY720作為FDA批準的用來治療復發-緩解型多發性硬化（MS）的口服免疫調節藥物，能通過血腦屏障，可作為用于臨床的具有神經保護作用的潛在藥物，以減輕腎缺血再灌注對神經認知的影響。

本研究采用SD大鼠建立RIRI模型，結果顯示RIRI組大鼠腎組織和海馬組織CAI區出現了明顯的病理損傷，同時RIRI組大鼠海馬組織CA1區出現了大量的TUNEL染色陽性細胞，表明RIRI可導致大鼠海馬組織CA1區神經細胞發生凋亡，表明腎缺血再灌注引起腦損傷模型造模成功。Morris水迷宮實驗是目前公認的客觀評價學習記憶功能的實驗方法，主要用于研究海馬損傷與空間學習記憶能力的關系[15]，本研究采用Morris水迷宮實驗研究RIRI對認知功能的影響發現，與Sham組相比，RIRI組大鼠學習能力和空間記憶能力顯著降低，與Barbosa PR等人[16]的研究結果一致，提示RIRI能夠引起大鼠海馬組織CA1區的神經細胞損傷，從而導致大鼠認知功能障礙。術后認知功能障礙的確切機制仍不明確，其中手術創傷引起的組織損傷激活機體先天性免疫系統，導致細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β[17-18]等大量釋放是重要原因。細胞因子能夠在相對薄弱的室周區，以主動轉運方式穿過血腦屏障進入大腦，細胞因子也可刺激迷走神經傳入纖維，進而激活中樞炎性反應通路，上述兩種途徑導致中樞神經系統內小膠質細胞激活，活化的小膠質細胞進一步合成和釋放TNF-α、IL-6、IL-1β，細胞因子和小膠質細胞活化共同造成中樞神經系統炎癥反應，最終導致認知功能障礙。但仍有研究表明[19-20]，FTY720能為病理環境中的神經元提供神經保護效應，主要是通過上調神經元細胞上Bcl-2/Bax蛋白的結合率，下調凋亡蛋白Caspase-3的表達水平，從而發揮抗細胞凋亡效應，有效改善認知功能障礙。本研究發現，FTY720組大鼠海馬組織CA1區病理損傷、神經細胞凋亡數顯著低于RIRI組，提示FTY720對RIRI大鼠腦組織損傷有保護作用，且水迷宮實驗顯示，FTY720組大鼠學習能力和空間記憶能力較RIRI組有顯著改善，提示FTY720能夠一定程度地改善RIRI引起的大鼠認知功能障礙。Western blot結果顯示，與RIRI組相比，FTY720組大鼠海馬組織CA1區Caspase-3的表達水平顯著降低，提示FTY720可通過下調海馬組織CA1區Caspase-3的表達從而發揮抗神經細胞凋亡的作用，與Di Menna L[20]等人研究結果相一致。

綜上所述，RIRI造模大鼠可引起遠隔器官腦組織的損傷和認知功能障礙，FTY720干預能顯著改善大鼠RIRI引起的腦損傷和認知功能障礙，其機制可能與FTY720抑制Caspase-3的表達，從而減少海馬組織CA1區神經元細胞凋亡有關。本研究為FTY720作為腎缺血再灌注引起腦損傷的潛在治療藥物提供了一定的基礎。